[发明专利]禽流感病毒三聚体亚单位疫苗及其应用

说明书

本发明公开了基于三聚化HA的亚单位禽流感病毒疫苗。本发明使用昆虫细胞体外表达流感病毒H1N1 HA蛋白三聚体形成区域LAH在N端、H7N9 HA1或H5N1 HA1蛋白在C端的融合三聚体蛋白H7N9 HA1c‑trimer、H5N1 HA1c‑trimer，且与各自HA1单体蛋白相比，三聚体蛋白的免疫效果更好，能够使小鼠产生更高滴度的针对流感病毒HA1的特异性抗体。本发明的三聚体形式HA1克服了HA1单体免疫原性不足的缺点，提高了小鼠产生的针对流感病毒HA1的特异性抗体水平；这种设计可以用于提高流感病毒HA1免疫原性，使其作为一种更为有效地疫苗使用。

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及禽流感病毒三聚体亚单位疫苗及其应用。

背景技术

流行性感冒病毒(influenza virus)，简称流感病毒。是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的代表种，包括人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，是流感的病原体。

流感病毒是一种负链RNA病毒，包含编码至少12种蛋白质的八个RNA片段(PB2，PB1，PB1-F2，PA、PA-X、HA、NA、NP、M1、M2、NS1和NS2)。其中两种蛋白质，血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，是细胞表面糖蛋白，使病毒能够分别进入(通过受体结合和膜融合)和逃离宿主细胞；由于HA和NA容易在传播过程中发生突变，导致免疫原性发生改变，所以根据的HA和NA抗原性区别，流感病毒又可以分为不同的亚型，例如H1N1、H5N1、H3N2等。

HA是病毒颗粒的主要表面抗原，也是病毒中和抗体(Abs)的主要目标，HA是一种合成为单个多肽链(HAO)的同源三聚体，随后被宿主细胞蛋白酶切割以达到具有融合能力的状态。因此，成熟的HA三聚体由HA1和HA2亚单位组成，它们在切割后通过一个二硫键保持交联。HA三聚体可分为两个结构和功能域，头部和茎，分别包括受体结合位点和融合机制。HA1亚单位形成膜远端的球状头部和膜近端茎部区的一部分。HA2亚单位代表茎部区的主要成分。HA的头部介导受体结合，而HA2亚单位代表茎部区是介导膜融合作用的主要部分。中和抗体反应主要针对HA的免疫显性结构域。然而，由于头部区域表位的高度遗传可塑性，抗体反应是毒株特异性的，缺乏与不同HA亚型的广泛交叉反应性。相比之下，HA茎部的序列和结构在不同的流感亚型中更加保守，广泛中和该结构域的抗体被认为是对抗各种流感病毒株的潜在方法。虽然不同亚型的HA氨基酸序列存在差异，但是其HA1的氨基酸数量及空间结构具有很强的保守性，通过结构生物学解析的不同亚型HA比较我们发现，其空间结构基本一致。

最保守的HA茎部区之一是55个氨基酸长的d螺旋(LAH)。已有研究表明，在体外表达的LAH能够自发组装成为可溶性的三聚体蛋白复合物，这也和HA在病毒表面形成天然三聚体有紧密的联系。利用这一特点，可以将LAH与重要病毒抗原蛋白融合，形成依赖于LAH的三聚体可溶蛋白，提高抗原的免疫原性。