[发明专利]一种蔗糖磷酸化酶及葡萄糖-1-磷酸生产工艺

权利要求书

1.一种葡萄糖-1-磷酸的生产工艺，其特征在于：取蔗糖母液，加入缓冲液、纯水，加入含有蔗糖磷酸化酶的粗酶液，37℃反应；所述蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的葡萄糖-1-磷酸的生产工艺，其特征在于，所述粗酶液的制备方法包括以下步骤：

（1）通过全基因合成的方法，将SEQ ID NO：1所示蛋白的对应编码多核苷酸序列进行组装，并克隆到原核表达载体表达，以实现在大肠杆菌中的高表达；

（2）摇瓶发酵

挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10mL高压灭菌后的培养基A中，30℃，250rpm过夜培养；所述培养基A为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L；

次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100mL高压灭菌后的培养基B中，于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时；加IPTG 至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时；所述培养基B为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾 3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L；

培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体；然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存；同时取2克菌体加入6mL纯水超声破碎后进行 SDS-PAGE检测，并将粗酶液-20℃保存；

或者，分批补料发酵：

分批补料发酵在计算机控制的生物反应器中进行，采用初级接种菌种制备200mL培养物，当培养物为OD2.0时接入所述生物反应器，所述菌种为步骤（1）制备获得的含有表达载体的大肠杆菌；在整个发酵过程中，温度保持在37℃，发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率和通气供应级联自动控制在30％，而培养基的pH值由50% v/v正磷酸和30%v/v氨水维持在7.0；

发酵过程中，当出现大幅的溶氧回升时，开始补料，补料溶液含有9%w/v蛋白胨、9％w/v酵母提取物、14％w/v甘油；当OD600为35.0时，用0.2mM IPTG诱导16小时；取2克菌体加入6mL纯水超声破碎后进行SDS-PAGE检测，并将粗酶液-20℃保存。

3. 根据权利要求2所述的葡萄糖-1-磷酸的生产工艺，其特征在于：粗酶液制备方法的步骤（2）中分批补料发酵所用的培养基为：酵母抽提物24g/L，蛋白胨12g/L，0.4％w/v葡萄糖，2.31g/L磷酸二氢酶和12.54g/L磷酸氢二钾，pH 7.0。