[发明专利]一种产1,3-丙二醇的基因工程菌有效
申请号: | 202111660305.1 | 申请日: | 2021-12-31 |
公开(公告)号: | CN114276970B | 公开(公告)日: | 2023-06-27 |
发明(设计)人: | 谭天伟;李明达 | 申请(专利权)人: | 北京化工大学 |
主分类号: | C12N1/21 | 分类号: | C12N1/21;C12N15/70;C12N15/60;C12N15/54;C12N15/53;C12N15/52;C12P7/18;C12R1/19 |
代理公司: | 北京睿邦知识产权代理事务所(普通合伙) 11481 | 代理人: | 方莉 |
地址: | 100029 *** | 国省代码: | 北京;11 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 丙二醇 基因工程 | ||
1.一种产1,3-丙二醇的基因工程菌,其为包含编码天冬氨酸脱羧酶的基因panD、编码β-丙氨酸-丙酮酸氨基转移酶的基因bauA、编码3-羟基酸脱氢酶的基因ydfG、经过密码子优化的编码醛脱氢酶的基因pdup、编码醇脱氢酶的基因yqhD、经过密码子优化的编码3-羟基丙酰辅酶A合成酶的基因Msed_1456的重组宿主菌;所述宿主菌为大肠杆菌BW25113;
所述基因工程菌合成1,3-丙二醇的途径如下:
(1)葡萄糖在微生物自身糖酵解途径的作用下生成草酰乙酸;
(2)草酰乙酸在天冬氨酸氨基转移酶的作用下生成L-天冬氨酸;
(3)L-天冬氨酸在天冬氨酸脱羧酶的催化作用下生成β-丙氨酸;
(4)β-丙氨酸在β-丙氨酸-丙酮酸氨基转移酶的催化作用下生成丙二酸半醛;
(5)丙二酸半醛在3-羟基酸脱氢酶的催化作用下生成3-羟基丙酸;
(6)3-羟基丙酸在3-羟基丙酰辅酶A合成酶的催化作用下生成3-羟基丙酰辅酶A;
(7)3-羟基丙酰辅酶A在醛脱氢酶的催化作用下生成3-羟基丙醛;
(8)3-羟基丙醛在醇脱氢酶的催化作用下生成1,3-丙二醇。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌,其特征在于,所述编码天冬氨酸脱羧酶的基因panD来源于枯草芽孢杆菌168株(Bacillus subtilis strain 168),其序列如SEQ No.1所示;和/或,所述编码β-丙氨酸-丙酮酸氨基转移酶的基因bauA来源于铜绿假单胞菌PAO1(Pseudomonas aeruginosa PAO1),其序列如SEQ No.2所示。
3.根据权利要求1所述的基因工程菌,其特征在于,所述编码3-羟基酸脱氢酶的基因ydfG来源于大肠杆菌K12株 (Escherichia coli strain K12) ,其序列如SEQ No.3所示。
4. 根据权利要求1所述的基因工程菌,其特征在于,所述编码醛脱氢酶的基因pdup来源于肠道沙门氏菌(Salmonella enterica),所述经过密码子优化的编码醛脱氢酶的基因pdup的序列如SEQ No.4所示。
5. 根据权利要求1所述的基因工程菌,其特征在于,所述编码醇脱氢酶的基因yqhD来源于大肠杆菌K12株(Escherichia coli strain K12) ,其序列如SEQ No.5所示。
6. 根据权利要求1所述的基因工程菌,其特征在于,所述编码3-羟基丙酰辅酶A合成酶的基因Msed_1456来源于金属球菌DSM 5348(Metallosphaera sedula DSM 5348),所述经过密码子优化的编码3-羟基丙酰辅酶A合成酶的基因Msed_1456的序列如SEQ No.6所示。
7.一种如权利要求1-6中任意一项所述的基因工程菌在生产1,3-丙二醇中的应用;所述应用包括将产1,3-丙二醇的基因工程菌接入发酵培养基,进行发酵培养,然后对所获得的发酵培养液进行分离纯化,制得1,3-丙二醇。
8. 根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述发酵培养的条件为:发酵培养时间为72h,当菌体生长至OD600=0.6~0.8时,加入IPTG,添加IPTG后,发酵温度从37℃转为30℃,IPTG诱导浓度为0.2 mM;体外添加天冬氨酸,且天冬氨酸添加量为2-10g/L。
9. 根据权利要求8所述的应用,其特征在于,天冬氨酸添加量为5-10 g/L。
10.根据权利要求7-9中任意一项所述的应用,其特征在于,对所获得的发酵培养液进行分离纯化包括:
步骤S1,对发酵培养液进行第Ⅰ次离心分离,获得第Ⅰ上清液;
步骤S2,用乙腈将第Ⅰ上清液稀释1000倍,混匀后,获得溶液A;取200μL溶液A加入10μL三氯乙酰异氰酸酯进行衍生化,混匀;向衍生化后的溶液中加入190μL超纯水,混匀,获得第Ⅱ上清液;步骤S3,用0.22 μm的有机相滤膜过滤第Ⅱ上清液,获得1,3-丙二醇。
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