[发明专利]一种用于少刺、散磷草鱼突变体鉴定的分子标记及方法

权利要求书

1.一种用于少刺、散磷草鱼突变体鉴定的分子标记，其特征在于该分子标记的为E1M4S和E6M7S，各引物核苷酸序列如下：

上游引物E1M4S-F如SEQ.ID No1所示；

下游引物E1M4S-R如SEQ.ID No2所示；

上游引物E6M7S-F如SEQ.ID No3所示；

下游引物E6M7S-R如SEQ.ID No4所示。

2.一种利用权利要求1所述的用于少刺、散磷草鱼突变体鉴定的分子标记的鉴别方法，其特征在于该鉴别方法包括以下步骤：1）首先提取草鱼基因组DNA，并稀释备用；2）建立酶切-连接反应；3）建立预扩增反应体系和预扩增反应程序；4）建立选择性扩增体系和反应程序；5）聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后获得所需条带。

3.如权利要求2所述的一种用于少刺、散磷草鱼突变体鉴定的分子标记的鉴别方法，其特征在于步骤1）中，提取的是散磷草鱼基因组DNA，稀释成200ng/μL。

4.如权利要求2所述的一种用于少刺、散磷草鱼突变体鉴定的分子标记的鉴别方法，其特征在于步骤2）中酶切-连接反应具体为：取200ng基因组DNA，用EcoR I和Mse I进行37℃双酶切4 h后,75℃灭火15min，酶切片段与EcoR I和Mse I接头连接，22℃过夜。

5.如权利要求2所述的一种用于少刺、散磷草鱼突变体鉴定的分子标记的鉴别方法，其特征在于步骤3）中预扩增反应体系为：10×Buffer:溶液2μL, dNTP( 2.5 mM) 2μL, EcoRI预扩增引物(2.5 μM) 1μL, Mse I预扩增引物(2.5μM) 1μL, rTaq酶1.0 U, 连接产物3μL,用去离子灭菌水补足20μL；预扩增反应程序为: 94℃预变性5min, 接着94℃变性20s,56℃退火30 s, 72℃延伸2min，20个循环之后72℃延伸10 min。

6.如权利要求2所述的一种用于少刺、散磷草鱼突变体鉴定的分子标记的鉴别方法，其特征在于步骤4）中选择性扩增体系为：10×Buffer 溶液1.5μL, dNTP( 2.5mM) 1.2μL,EcoR I选扩引物(2.5 μM) 1μL, MseI选扩引物(2.5 μM) 1μL, rTaq酶2.0 U, 预扩产物1μL,用去离子灭菌水补足15μL；选扩反应程序为: 94℃预变性5 min, 接着94℃变性30s, 65℃（以后每循环降低1℃）退火30s, 72℃延伸1 min进行10个循环；然后94℃变性30s, 56℃退火30s，72℃延伸1min进行24个循环，72℃延伸7min。

7.如权利要求2所述的一种用于少刺、散磷草鱼突变体鉴定的分子标记的鉴别方法，其特征在于步骤5）中，选择性扩增产物加入等体积载样缓冲液在非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行250V恒电压电泳，染色程序参考CARLOS JS的方法，漂洗之后进行拍照、记录、分析。