[发明专利]活动精子DNA碎片检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种活动精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，包括：

Pi检测试剂，其为荧光物质与银的络合物，当Pi存在时，Pi取代络合物中的银，使得被猝灭的荧光物质恢复荧光；

酸化液，其包括盐酸、氯化钠和曲拉通X-100；

缓冲液，其包括氯化钠、乙二胺四乙酸、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和柠檬酸；

以及AO染色液。

2.根据权利要求1所述的活动精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述酸化液包括：0.05-0.2mol/L的盐酸、0.1-0.5mol/L的氯化钠和质量分数0.02-0.2％的曲拉通X-100。

3.根据权利要求2所述的活动精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括：0.1-0.5mol/L的氯化钠、0.2-2mmol/L的乙二胺四乙酸、0.005-0.03mol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、0.05-0.2mol/L的磷酸氢二钠、0.05-0.2mol/L的柠檬酸。

4.根据权利要求1所述的活动精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述荧光物质为碳量子点，其通过以下方法制备得到：

1)将番茄红素、二硫苏糖醇溶于乙醇和水的混合溶液中，再加入乙二胺，搅拌；

2)将步骤1)得到的溶液转移到反应釜中，加热反应；

3)反应结束后，将产物过滤，滤液干燥得到粗产品；

4)将粗产品溶于超纯水中，离心，将离心液透析，收集透析袋内溶液，冷冻干燥，即得所述碳量子点。

5.根据权利要求4所述的活动精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述碳量子点通过以下方法制备得到：

1)将番茄红素、二硫苏糖醇溶于乙醇和水的混合溶液中，超声搅拌至澄清，再加入乙二胺，搅拌1-3分钟；

2)将步骤1)得到的溶液转移到聚四氟乙烯为内衬的反应釜中，在烘箱中加热至130℃-160℃下持续反应4-12小时；

3)反应结束后，待产物冷却至室温，再用滤膜过滤产物，将滤液冷冻干燥得到粗产品；

4)将粗产品溶于超纯水中，离心，取滤液用截断分子量为800-1500Da的透析袋透析8-16小时，收集透析袋内溶液，冷冻干燥，即得所述碳量子点。

6.根据权利要求5所述的活动精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述Pi检测试剂的制备方法为：将碳量子点溶于去离子水中，搅拌溶解，然后再加入足量的银离子，混合得到Pi检测试剂，避光保存。

7.根据权利要求6所述的活动精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述Pi检测试剂的制备方法为：将碳量子点溶于去离子水中，搅拌溶解，配置成10μg/mL的碳量子点溶液，然后再加入足量的硝酸银，混合得到Pi检测试剂，避光保存。

8.一种活动精子DNA碎片检测方法，其特征在于，其使用权利要求1-7中任意一项所述的试剂盒进行活动精子DNA碎片的检测，该方法包括以下步骤：

S1、用缓冲液将精子样品稀释，得到精子稀释液；

S2、向精子稀释液中酸化液，处理15-120s；

S3、向步骤S2得到的产物中加入缓冲液，然后加入Pi检测试剂，漩涡混匀，反应5-60min；

S4、向步骤S3得到的产物中加入AO染色液，混匀；

S5、将步骤S4得到的产物上流式细胞仪检测，收集精子的蓝色、绿色和红色荧光；

结合三种荧光检测结果进行分析：先通过蓝色荧光检测出活动的精子，然后根据绿色荧光和红色荧光分析得到活动的精子中的DNA碎片率。