[发明专利]一种瓜类细菌性果斑病菌的RPA检测引物、探针及检测方法有效
| 申请号： | 202111666812.6 | 申请日： | 2021-12-31 |
| 公开（公告）号： | CN114277166B | 公开（公告）日： | 2022-11-25 |
| 发明（设计）人： | 曾蓉;戴富明;徐丽慧;宋志伟;高萍;高士刚 | 申请（专利权）人： | 上海市农业科学院 |
| 主分类号： | C12Q1/689 | 分类号： | C12Q1/689;C12N15/11;C12Q1/6844 |
| 代理公司： | 上海开祺知识产权代理有限公司 31114 | 代理人： | 张晓敏;费开逵 |
| 地址： | 201106 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 细菌性 病菌 rpa 检测 引物 探针 方法 | ||
1.一种基于RPA结合侧流试纸检测瓜类细菌性果斑病菌的检测方法，包括以下步骤：
a.向RPA反应体系中加入瓜类细菌性果斑病菌的模板DNA、RPA引物对Ac-F1、Ac-R1和检测探针Ac-nfo，其中，RPA引物对Ac-F1和Ac-R1的扩增产物大小为342bp，引物Ac-R1的5'末端标记生物素，检测探针Ac-nfo的5’末端标记FAM，3’末端标记C3Spacer，探针中间距5’末端32bp位置处采用dSpacer修饰，具体核苷酸序列如下：
Ac-F1:5’-ACAACGATGTTGTCATTAAATTGGCGAGGATGG-3’；
Ac-R1:5’-Biotin-TGAAGTCCAAGCCAGCTGAAAGTACTACCTTTG-3’；
Ac-nfo:5’-[6FAM]-GCCGCATTGAAAACCGTCGTCGTGATGGAGA[THF]G
ACGCCGCCAGAAGC-[C3Spacer]-3’；
b.36-38℃恒温孵育反应管15-20min，吸取反应管中的反应液，并与无菌去离子水混匀至新的反应管中；
c.以无菌水为阴性对照，将核酸检测试纸条的测试端插入步骤b中混合后的反应管中，反应2-5min，待反应完成后根据试纸显色结果判定检测结果对照。
2.根据权利要求1所述基于RPA结合侧流试纸检测瓜类细菌性果斑病菌的检测方法，其特征在于，步骤a)中所述RPA反应体系中：Ac-F1和Ac-R1的终浓度各为0.4pmol/μL、醋酸镁14mmol/μL。
3.根据权利要求1所述基于RPA结合侧流试纸检测瓜类细菌性果斑病菌的检测方法，其特征在于，步骤a)中RPA反应体系中：Ac-F1和Ac-R1的终浓度各为0.4pmol/μL、Ac-nfo0.12pmol/μL、醋酸镁14mmol/μL。
4.根据权利要求1-3任一项所述基于RPA结合侧流试纸检测瓜类细菌性果斑病菌的检测方法，其特征在于，所述瓜类细菌性果斑病菌的模板DNA为瓜类细菌性果斑病菌菌液。
5.根据权利要求1-3任一项所述基于RPA结合侧流试纸检测瓜类细菌性果斑病菌的检测方法，其特征在于，步骤a)中，采集植株叶片，加入无菌水，充分研磨得到研磨汁液，将所述研磨汁液作为模板DNA直接进行PRA检测。
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