[发明专利]预包装饮用水中两种致病菌的双重荧光定量PCR检测方法及试剂盒

说明书

本发明公开了预包装饮用水中两种致病菌的双重荧光定量PCR检测方法及试剂盒。所述试剂盒包含检测铜绿假单胞菌和粪链球菌的引物及探针(SEQ ID NO:1‑6)。本发明试剂盒特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度好，为预包装饮用水中铜绿假单胞菌和粪链球菌两种致病菌检测提供了新的方法。本发明提供的双重荧光定量PCR法可以准确快速地实现饮用水中铜绿假单胞菌和粪链球菌的检测，1天内即可完成检测，具有快速、特异、敏感、高通量、稳定性好、节约试剂成本等优点，适用于饮用水标准中铜绿假单胞菌和粪链球菌两种致病菌指标。

技术领域

本发明涉及荧光定量PCR检测技术，具体地说，涉及预包装饮用水中两种致病菌(铜绿假单胞菌和粪链球菌)的双重荧光定量PCR检测方法及试剂盒。

背景技术

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种常见的水源性和食源性致病菌，其进入机体内经大量增殖后可生成诸如胞外酶、内毒素、肠毒素以及溶血素等多种有害物质，致使被感染人动物的组织器官病变甚至坏死，进而引起急性胃肠炎、败血症和脑膜炎等病症，严重威胁生命健康。在人们日常生产生活中，铜绿假单胞菌在各类型水中均存在，且其对水处理中使用的消毒剂、紫外线等理化手段具有较强的抵抗力，因而容易通过饮水进入人体内造成感染。粪肠球菌(Enterococcus faecalis)主要来自人类和温血动物的粪便，与其他肠道菌相比，它们在水中存活时间更长，因此被视为粪便污染指示菌。当前，各类包装饮用水与人们的日常生活息息相关，然而由于市场上出现的相关厂家众多、品类繁杂，其产品极易因生产环节不达标而受到此两种菌的污染，直接影响到广大消费者的身体健康。据统计，目前国内外有关包装饮用水中检出铜绿假单胞菌的报道日趋增多，其受该菌污染的概率高达1.4％。因此，有关包装饮用水中铜绿假单胞菌污染的问题越来越受到社会各界关注。我国在GB 19298-2014中明确规定了包装饮用水需采用三级取样法抽样检测铜绿假单胞菌和粪链球菌，而且必须参照GB 8538-2016严格检测该菌，并明确规定各类抽检水样品中均不得检出。上述标准中给出的检测方法仍为传统的分离培养、形态学镜检观察以及生化鉴定等，且该类检测必须依托实验室并由专业人员完成，普遍存在耗时长，可疑样品至少需要2天以上、流程繁琐等弊端。随着PCR技术的发展，采用该技术用于微生物种类的鉴定成为可选方法之一。特别是多重real-time PCR技术可针对多个不同菌种设计引物和探针，可实现多个菌种检测一次完成，具有操作流程简便、灵敏度高、耗时短以及检测费用低等优势，为微生物快速检测提供了一种快速便捷的技术手段。目前，在饮用水中微生物检测的专利主要有：(1)饮用水中主要病原微生物的基因芯片及检测用试剂盒(CN101748192B)。该方法采用基因芯片，基于杂交探针检测目标微生物(12种)。虽然检测的微生物种类多，但检测对象与预包装饮用水标准要求相差较大，试剂种类繁多且采用杂交探针法，步骤繁琐，耗时，灵敏度低。(2)检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR引物组、探针组、试剂盒及方法(公布号为CN 108004334 A)。该方法采用四重荧光PCR检测饮用水中大肠杆菌、铜绿假单胞菌菌、粪链球菌和产气荚膜梭菌。取样体积为1L，检出限10³CFU/L，检测时间为2～3天。取样体积与预包装饮用水标准要求(250mL)不相符；检出限无法满足该标准中对致病菌限量要求(致病菌不得检出)；检测时间较长(2～3天)。因此，开发一种与预包装饮用水标准相匹配的快速检测方法及试剂盒有非常重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供预包装饮用水中两种致病菌(铜绿假单胞菌和粪链球菌)的双重荧光定量PCR检测方法及试剂盒。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一对铜绿假单胞菌特异性PCR引物(根据铜绿假单胞菌gyrB基因设计)，包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物和如SEQ ID NO:2所示的下游引物。铜绿假单胞菌gyrB基因在GenBank中的参考序列编号为AB005881.1，SEQID NO:1和2扩增的靶区段位于gyrB基因第2286bp～2352bp，扩增片段长度为67bp。