[发明专利]识别多种抗原的兔B淋巴细胞的筛选方法、多种兔源工程化抗体的制备方法

说明书

本发明涉及一种识别多种抗原的兔B淋巴细胞的筛选方法、多种兔源工程化抗体的制备方法，属于生物技术领域。本发明的筛选方法包括以下步骤：1)采用两种以上的免疫原共同免疫兔子后，取外周血中分离出PBMCs细胞，然后利用B淋巴细胞表面标志负筛提高B淋巴细胞的丰度，再依次利用荧光染料标记或未标记的IgG抗体、预标记筛选用抗原进行分选，挑选表达识别各免疫原的B淋巴细胞；所述预标记筛选用抗原是将生物素标记的各免疫原与亲和素标记的荧光染料进行孵育得到；2)然后对分选出的B淋巴细胞铺板培养，筛选识别各种免疫原的细胞阳性孔。该筛选方法利用预标记筛选用抗原进行抗原特异性筛选，可以更好地筛选出识别各免疫原的B淋巴细胞。

技术领域

本发明涉及一种识别多种抗原的兔B淋巴细胞的筛选方法、多种兔源工程化抗体的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

单克隆抗体随着诊断与治疗领域的不断发展，应用面越来越广。上世纪70年代，随着利用小鼠骨髓瘤细胞与脾细胞融合制备鼠源单克隆抗体技术的出现，鼠源单克隆抗体得以快速的发展。这为后来的免疫诊断领域(如酶联免疫、化学发光、胶体金、流式细胞术等)相关技术的发展提供了基础。

伴随着鼠源单克隆抗体的发展，在2000年左右，朱伟民等学者借鉴鼠源单抗制备利用骨髓瘤细胞系融合脾脏细胞的方式，开发出了240E兔骨髓瘤细胞系，并成功制备了可分泌兔单克隆抗体的杂交瘤细胞。兔单克隆抗体的优点相较与鼠单克隆抗体，有着更高的亲和力，且兔子个体较大，免疫系统发达，便于实现高通量，对于一次免疫筛选获得优秀抗体的概率更高，因此，兔单克隆抗体在诊断领域的应用变得越来越广。

相较于融合制备兔单克隆抗体的方法，目前采取B细胞分离、培养，B细胞分离、抗体基因调取或者利用基于噬菌体展示技术的兔单克隆抗体制备手段成为主流。而B细胞分离及培养更便于早期发现优秀抗体细胞株，可大大减轻后续表达分析工作，因此成为研究热点。尽管兔子本身免疫周期较长，单个目标抗体开发的流程并不能压缩或者精简，抗体制备时间周期长，但兔子免疫系统较小鼠发达，免疫过程中可同时实现多种免疫原共免疫的方法，有助于一次免疫获得多种兔源单克隆抗体的实现。

虽早有专利在鼠源单克隆抗体制备过程中提及多种免疫原免疫，可实现一次免疫融合获得多种抗体的效果(如申请公布号为CN1446923A以及CN1880447A的中国专利文献)。但是在兔骨髓瘤细胞系的建立耗时长并且具有随机性，并且商品化生产兔单抗抗体的过程中需要配套专用的培养基，开发成本高。此外兔子B细胞表面没有特异性的表面标志物，无法像小鼠免疫后无需考虑参与融合的脾脏细胞中肯定会有B细胞这一特点，这加大了在采用多种免疫原对兔子免疫后，识别所有目标免疫原的兔B淋巴细胞的分离难度。

发明内容

本发明的目的是提供一种识别多种抗原的兔B淋巴细胞的筛选方法，能够同时筛选识别多种免疫原的兔B淋巴细胞，大大降低了分离难度。

本发明还提供了一种多种兔源工程化抗体的制备方法。

为了实现以上目的，本发明的识别多种抗原的兔B淋巴细胞的筛选方法所采用的技术方案是：

识别多种抗原的兔B淋巴细胞的筛选方法，包括以下步骤：

1)采用两种以上的免疫原共同免疫兔子后，取外周血中分离出PBMCs细胞，然后利用B淋巴细胞表面标志负筛提高B淋巴细胞的丰度，再依次利用荧光染料标记或未标记的IgG抗体、预标记筛选用抗原进行分选，挑选表达识别各免疫原的B淋巴细胞；所述预标记筛选用抗原是将生物素标记的各免疫原与亲和素标记的荧光染料进行孵育得到；

2)然后对分选出的B淋巴细胞铺板培养，筛选识别各种免疫原的细胞阳性孔。