[发明专利]特异性抗异丙甲草胺碳手性抗体的可变区序列及其重组全长抗体的制备

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体公开了特异性抗异丙甲草胺碳手性抗体的可变区序列及其重组全长抗体的制备，本发明公开的抗ɑSS‑MET和抗ɑSR‑MET重组全长抗体的重链可变区、轻链可变区序列来源于经多次免疫小鼠、细胞融合及筛选得到的高特异性单克隆细胞株。将所述可变区基因序列通过T2A元件与重链恒定区基因和轻链恒定区基因连接，构建重组表达载体，采用慢病毒转染的方式转到哺乳动物细胞表达，获得了抗ɑSS‑MET和抗ɑSR‑MET重组全长抗体，所述重组全长抗体维持了鼠源亲本单抗的抗体活性，并使得不同碳手性的抗异丙甲草胺抗体可大批量稳定生产，为异丙甲草胺残留检测的快速免疫分析方法提供了可靠的核心试剂。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地，涉及特异性抗异丙甲草胺碳手性抗体的可变区序列及其重组全长抗体的制备。

背景技术

异丙甲草胺(Metolachlor，MET)属于氯代乙酰胺类化合物，是一种重要的酰胺类选择性除草剂，因其具有高效、广谱、适应性强等特点，被广泛应用于全世界范围内的70多种作物田的杂草防除，是我国目前生产和使用量最大的除草剂之一。MET同时具有碳手性和轴手性两个手性中心，因此有4个光学异构体，分别为ɑSS，ɑSR，ɑRS，ɑRR。MET作为一种手性农药，其95％的除草活性主要是由S-型对映体所贡献。因此，目前市售的异丙甲草胺农药产品有两种，一种为外消旋产品(Rac-型，又名都尔)，另一种为S-构型产品(S-型，又名金都尔)。世界卫生组织(WHO)通过研究发现异丙甲草胺是导致大鼠肝增殖性病变的主要原因，美国环保署(US EPA)将异丙甲草胺归为C类农药，为潜在的致癌物质。

已有研究表明，Rac-型与S-型异丙甲草胺对映体在毒理学方面存在很大差异，例如，Rac-型异丙甲草胺对大型蚤的生理毒性是S-型异丙甲草胺的50～100倍。目前，我国使用的手性农药已超过40％，其生物活性和毒性作用均具有对映体选择性。然而，手性农药长期被当作单一物质来对待，也未有相应的限量标准，因此有必要从对映体水平上对手性农药进行单独检测分析。

目前，针对消旋异丙甲草胺的检测方法主要有高效液相色谱-质谱联用、气相色谱-质谱联用、吸收光谱等方法，但由于仪器设备昂贵，检测成本高，还需要复杂的预处理程序和研究人员的专业度需求，使其不能满足快速筛选和检测样品的要求。对于手性药物的检测，仅通过以上方法不能完全分辨，还需要结合手性衍生化试剂及手性柱才能实现。近年来，免疫分析方法以其灵敏度高、简单快速和易于操作等优势在食品检测领域中占据重要地位，而该方法的核心技术在于抗体制备。第一代抗体-多克隆抗体，即多种抗原决定簇刺激机体，因而产生含有多种针对不同抗原表位的抗体，易发生交叉反应、特异性较差。第二代抗体-单克隆抗体，具有高灵敏度、高特异性、抗体成分均一等特点，逐渐成为免疫分析的核心材料。

中国发明专利CN110054576A公开了一种异丙甲草胺手性半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用，但制备小分子类物质的抗体必须经过衍生化制备半抗原、与载体蛋白偶联制备抗原、再进行动物免疫等一系列复杂过程，制备周期长、花费大，最终获得的抗体还会时常出现无免疫效果的现象。

随着人们对抗体基因结构的解析以及分子生物学技术的迅速发展，基因工程技术已成为抗体应用的研究前沿。重组抗体包括小分子抗体(单链抗体、Fab抗体)、全长抗体、嵌合抗体等，开发具有高灵敏、高特异的新型抗体一直是免疫检测技术的恒定目标。在各类重组抗体表达体系中，哺乳动物表达系统具有复杂的蛋白质折叠、组装和翻译后修饰等多种特性，所产生的重组抗体最近似于天然蛋白，这不仅证实了亲本抗体可变区序列的准确性，还解决了传统抗体制备遇到的问题，如抗体的批次间差异、杂交瘤细胞保存不当或时间久远而出现抗体发生突变、功能丧失等问题。因此，在抗体基因序列已知的情况下，就可以在体外大量生产不同类型的重组抗体，无需动物免疫，制备周期短，操作简便，有利于高效快速的免疫检测技术的发展和应用。因此，开发出针对异丙甲草胺无需动物免疫，制备周期短，操作简便，有利于高效快速的免疫检测的重组抗体十分有必要。

发明内容