[发明专利]植物根际固氮菌多样性检测引物组、试剂盒及方法

权利要求书

1.植物根际固氮菌多样性检测引物组，其特征在于，包括：融合PCR引物组：

扩增固氮功能基因的引物对：F1引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；R1-F2'引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

扩增标记物种信息基因的引物对：R1-F2'引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；R2引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的植物根际固氮菌多样性检测引物组，其特征在于，还包括巢式PCR引物对：

F3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；R3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

3.用于植物根际固氮菌多样性检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1～2任一项所述的引物组及常用助剂。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括融合PCR试剂盒和巢式PCR试剂盒；所述融合PCR试剂盒包括融合PCR引物以及常用助剂；所述巢式PCR试剂盒包括巢式PCR引物以及常用助剂。

5.一种植物根际固氮菌多样性检测方法，其特征在于，采用权利要求1～2任一项所述的引物，所述方法包括：

对采集的植物样本进行预处理，得到菌悬液；

将经过细胞密度计算的菌悬液、乳化剂与融合PCR引物组混合，并在单细胞内将固氮功能基因和标记物种信息的基因连接并扩增，得到融合产物；

对融合产物进行萃取，并用琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化，得到纯化融合产物；

以纯化融合产物为模板，与巢式PCR引物组混合后，反应得到巢式PCR产物；

利用巢式PCR产物制备文库，并进行测序，根据测序结果分析植物根际固氮菌的多样性。

6.根据权利要求5所述的植物根际固氮菌多样性检测方法，其特征在于，所述固氮功能基因为nifH基因，标记物种信息的基因为16S rRNA基因。

7.根据权利要求5所述的植物根际固氮菌多样性检测方法，其特征在于，所述乳化剂包括以下体积分数的物质：4％UMIL EM90油、0.05％Triton X-100和95.95％为矿物油。

8.根据权利要求5所述的植物根际固氮菌多样性检测方法，其特征在于，所述利用巢式PCR产物制备文库前还包括：对巢式PCR产物用琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化，得到纯化巢式PCR产物。

9.根据权利要求5所述的植物根际固氮菌多样性检测方法，其特征在于，所述对融合产物进行萃取具体包括：

收集融合产物并进行第一离心处理，除去上层油相；

加入水饱和乙醚并进行第二离心处理，除去上层液相；

加入水饱和乙酸乙酯并进行第三离心处理，除去上层液相；

将所得物置于通风橱风干。

10.根据权利要求5所述的植物根际固氮菌多样性检测方法，其特征在于，所述细胞密度计算具体包括：

配置荧光试剂；

将ATP标准液稀释至不同浓度，制作标准曲线；

将荧光试剂加入菌悬液中，记录RLU值，并转化成ATP浓度，计算菌悬液的细胞密度。