[发明专利]深层发酵方法

权利要求书

1.一种生产一种或多种目的多肽的深层发酵方法，该方法包括：

a)在发酵液中发酵生产该一种多种目的多肽的一种或多种微生物，并且

b)将至少一种酶添加至该发酵液中；或与未添加或共表达该至少一种酶时相比，在该一种或多种微生物中共表达该至少一种酶并且将该至少一种酶以足以减少该发酵液的粘度分泌到该发酵液中；以及任选地

c)回收该一种或多种目的多肽。

2.如权利要求1所述的方法，其中该一种或多种目的多肽是单个多肽或两种或更多种多肽的混合物。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中该一种或多种多肽或该两种或更多种多肽的混合物是一种或多种酶，优选地是一种或多种分泌的酶；甚至更优选地，该多肽或该两种或更多种多肽的混合物选自水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、和转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、磷酸二酯酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶。

4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该至少一种酶以推注或连续添加的方式添加。

5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法是分批补料或连续补料的发酵方法，并且其中将该至少一种酶添加至补料中。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该至少一种酶选自糖基水解酶家族，优选地是胞壁质酶、几丁质酶、变聚糖酶、甘露聚糖酶、核酸酶和/或磷酸二酯酶；优选地该至少一种酶是胞壁质酶，甚至更优选地是GH24或GH25胞壁质酶；仍更优选地该至少一种酶包含以下氨基酸序列，该氨基酸序列和SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:453中任一个中显示的氨基酸序列或其成熟版本至少60％序列同一性；例如，至少65％序列同一性；例如，至少70％序列同一性；例如，至少75％序列同一性；例如，至少80％序列同一性；例如，至少85％序列同一性；例如，至少90％序列同一性；例如，至少95％序列同一性；例如，至少96％序列同一性；例如，至少97％序列同一性；例如，至少98％序列同一性；例如，至少99％序列同一性；或者甚至100％序列同一性。

7.如以上权利要求中任一项所述的方法，该方法包括向每kg发酵液中添加高达20,000mg的该至少一种酶；优选地高达15,000mg/kg；甚至更优选地高达10,000mg/kg；仍更优选地高达5,000mg/kg；甚至更优选地高达1,000mg/kg和以及最优选地高达500mg/kg。

8.如以上权利要求中任一项所述的方法，该方法包括当稀释4,000倍时，添加该至少一种酶，其活性范围是低于本文中描述的胞壁质酶测定的检测限，和高达本文中描述的胞壁质酶测定的0,200限；优选地当稀释3,000倍时；更优选地当稀释2,000倍时高达0,200；甚至更优选地当稀释1,000倍时高达0,200；仍更优选地当稀释500倍时高达0,200；最优选地当稀释100倍时高达0,200。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该至少一种酶包含两种或更多种酶，优选地是如前述权利要求中任一项所述的糖基水解酶和磷酸二酯酶。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该一种或多种微生物是细菌；优选地是原核生物；更优选地是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌；甚至更优选地该一种或多种微生物选自革兰氏阳性细菌，其包括芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、和链霉菌属；或者选自革兰氏阴性细菌，其包括弯曲杆菌、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、和脲原体属。