[发明专利]大分子非特异性清除测定

说明书

本文报道了一种用于确定抗体的非特异性清除的方法，所述方法包括以下步骤：将缀合至pH敏感性荧光染料的所述抗体与原代人内皮细胞一起孵育，以及确定所述原代人内皮细胞的荧光强度，其中所述原代人内皮细胞的所述荧光强度相对于背景水平的增加指示所述抗体的非特异性清除。

本文报道了一种使用新的基于人原代细胞的体外测定来估计人体内治疗性蛋白质的清除的新方法。这种大分子非特异性清除测定(LUCA)提供了基于体外的方法来评估和预测针对治疗性蛋白质的主要PK特性。

背景技术

G类人免疫球蛋白(IgG)包含传递对靶抗原的特异性的两个抗原结合(Fab)区以及负责与Fc受体相互作用的恒定区(Fc区)(参见例如Edelman,G.M.,Scand.J.Immunol.34(1991)1-22；Reff,M.E.and Heard,C.,Crit.Rev.Oncol.Hematol.40(2001)25-35)。IgG1、IgG2和IgG4亚类的人IgG的平均血清半衰期为21天，其比任何其他已知血清蛋白的血清半衰期都长(参见例如Waldmann,T.A.and Strober,W.,Prog.Allergy 13(1969)1-110)。这种长半衰期主要由Fc区和新生儿Fc受体(FcRn)之间的相互作用介导(参见例如Ghetie,V.andWard,E.S.,Annu.Rev.Immunol.18(2000)739-766；Chaudhury,C.,et al.,J.Exp.Med.197(2003)315-322。)。这就是为什么将IgG或含Fc的融合蛋白用作一类广泛的治疗剂的原因之一。

新生儿Fc受体FcRn是膜相关的受体，该受体参与IgG和白蛋白稳态、母体IgG跨胎盘转运和抗原IgG免疫复合物吞噬作用(参见例如Brambell,F.W.,et al.,Nature 203(1964)1352-1354；Ropeenian,D.C.,et al.,J.Immunol.170(2003)3528-3533)。人FcRn是由糖基化的I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)和β2微球蛋白(β2m)亚基组成的异二聚体(参见例如Kuo,T.T.,et al.,J.Clin.Immunol.30(2010)777-789)。FcRn与Fc区的CH2-CH3区中的位点结合(参见例如Ropeenian,D.C.and Akilesh,S.,Nat.Rev.Immunol.7(2007)715-725；Martin,W.L.,et al.,Mol.Cell 7(2001)867-877；Goebl,N.A.,et al.,Mol.Biol.Cell 19(2008)5490-5505；Kim,J.K.,et al.,Eur.J.Immunol.24(1994)542-548。)，并且两个FcRn分子可以同时与Fc区结合(参见例如Sanchez,L.M.,et al.,Biochemistry 38(1999)9471-9476；Huber,A.H.,et al.,J.Mol.Biol.230(1993)1077-1083。)。FcRn和Fc区之间的亲和力是pH依赖性的，在内体pH为5-6时显示纳摩尔级的亲和力，而在生理pH为7.4时显示相当弱的结合(参见例如Goebl,N.A.,et al.,Mol.Biol.Cell19(2008)5490-5505；Ober,R.J.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)11076-11081；Ober,R.J.,et al.,J.Immunol.172(2004)2021-2029)。可以通过三个基本步骤来解释将长半衰期传递给IgG的潜在机制。首先，IgG经受多种细胞类型的非特异性胞饮作用(参见例如Akilesh,S.,et al.,J.Immunol.179(2007)4580-4588；Montoyo,H.P.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106(2009)2788-2793。)。其次，IgG在pH为5-6时在酸性内体中遇到并结合FcRn，从而保护IgG免于溶酶体降解(参见例如Ropeenian,D.C.and Akilesh,S.,Nat.Rev.Immunol.7(2007)715-725；Rodewald,R.,J.Cell Biol.71(1976)666-669)。最后，在生理pH为7.4时，在细胞外空间中释放IgG(参见例如Ghetie,V.and Ward,E.S.,Annu.Rev.Immunol.18(2000)739-766)。这种严格的pH依赖性结合和释放机制对于IgG再循环至关重要，并且在不同pH值下的结合特性的任何偏差都可能强烈影响IgG的循环半衰期(参见例如Vaccaro,C.,et al.,Nat.Biotechnol.23(2005)1283-1288)。