[发明专利]使用进料速率变化的芽孢杆菌工业发酵工艺

权利要求书

1.一种培养芽孢杆菌属宿主细胞的方法，包括以下步骤：

(a)用芽孢杆菌属宿主细胞接种发酵培养基，所述芽孢杆菌属宿主细胞包含编码感兴趣的蛋白质的基因的表达构建体；和

(b)第一培养阶段，在有利于芽孢杆菌属宿主细胞生长和感兴趣的蛋白质表达的条件下在所述发酵培养基中培养所述芽孢杆菌属宿主细胞，其中芽孢杆菌属宿主细胞的培养包括加入至少一种进料溶液并且其中所述至少一种进料溶液以渐增的速率提供碳源；和

(c)第二培养阶段，在有利于芽孢杆菌属宿主细胞生长和感兴趣的蛋白质表达的条件下培养在步骤(b)获得的芽孢杆菌属宿主细胞培养物，其中所述培养包括加入至少一种进料溶液并且其中所述至少一种进料溶液以恒定速率、以渐减的速率或以小于步骤(b)中的速率的渐增的速率提供碳源，其中所述恒定速率或所述渐减的速率的起始速率或所述小于步骤(b)中的速率的渐增的速率的起始速率低于第一培养阶段的最大速率；

其中所述表达构建体包含与编码感兴趣的蛋白质的基因可操作地连接的诱导物非依赖性启动子或组成型活性启动子。

2.根据权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括从步骤(c)后获得的芽孢杆菌属宿主细胞培养物中获得所述感兴趣的蛋白质。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述感兴趣的蛋白质被分泌到发酵培养基中，优选其中所述感兴趣的蛋白质是酶。

4.根据权利要求1至3任一项的方法，其中所述启动子选自：veg启动子、lepA启动子、serA启动子、ymdA启动子、fba启动子、aprE启动子、amyQ启动子、amyL启动子、噬菌体SPO1启动子、cryIIIA启动子、其组合，以及其活性片段或变体。

5.根据权利要求1至4任一项的方法，其中步骤(b)中的所述渐增的速率是指数增加的速率。

6.根据权利要求5的方法，其中在所述第一培养阶段期间，所述至少一种进料溶液以至少约0.13h^-1的指数因子和至少约1g所述至少一种碳源的起始量以指数增加的速率提供碳源。

7.根据权利要求1至6任一项的方法，其中在所述第一培养期间，加入总量为至少约50g所述至少一种碳源/kg最初存在于步骤b)中的芽孢杆菌属宿主细胞培养物。

8.根据权利要求1或7任一项的方法，其中所述第一培养阶段进行至少约3小时直至约48小时的时间。

9.根据权利要求1至8任一项的方法，其中步骤(c)中的所述至少一种进料溶液以恒定速率提供所述碳源。

10.根据权利要求9的方法，其中所述恒定速率低于第一培养阶段的进料速率的最大速率。

11.根据权利要求10的方法，其中所述恒定速率在第一培养阶段中应用的所述至少一种碳源的最大进料速率的约70％至约20％的范围内，优选在约50％至约30％的范围内，或更优选为约35％。

12.根据权利要求1至11任一项的方法，其中所述第二培养阶段进行至少约3小时直至约120小时、至少约3小时直至约96小时、至少约40小时直至约120小时、或优选至少约40小时直至约96小时的时间。

13.根据权利要求1至12任一项的方法，其中所述芽孢杆菌属宿主细胞培养物在接种发酵培养基之后和第一培养阶段之前耗尽所述至少一种碳源。

14.根据权利要求1至13任一项的方法，其中在第一培养阶段期间的培养在第一温度进行并且在第二培养阶段期间的培养在第二温度进行，所述第二温度高于第一温度。

15.根据权利要求14的方法，其中所述第一温度和所述第二温度相差约3℃至约7℃、约4℃至约6℃，或优选相差约5℃。