[发明专利]牙龈组织及其制备方法

权利要求书

1.一种制备三维细胞组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)通过将纤维蛋白原、调节剂和口腔成纤维细胞与凝血酶混合，形成包含悬浮在支持基质内的口腔成纤维细胞的支持基质；

b)将所述支持基质在细胞培养基中孵育足够的时间，以允许所述三维细胞组合物的第一层发育；和

c)在所述第一层的表面上接种口腔角质形成细胞，并培养所述口腔角质形成细胞以形成所述三维细胞组合物的第二层。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述三维细胞组合物是人造牙龈组织。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述三维细胞组合物的第一层是固有层等效层。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述三维细胞组合物是人造口腔粘膜组织。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述口腔成纤维细胞是来自牙龈、牙周韧带、颊粘膜、腭粘膜、唇粘膜、舌粘膜或其他口腔粘膜表面。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述纤维蛋白原和调节剂在凝血酶存在下交联。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述口腔成纤维细胞的浓度为1x 10⁴至1x10⁶个细胞/ml。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述支持基质还包含内皮细胞。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述内皮细胞的浓度为1x 10⁵至4x 10⁶个细胞/ml。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述纤维蛋白原是人纤维蛋白原。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述纤维蛋白原的浓度是1.25至20mg/ml。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述调节剂的浓度是0.3至2.5mg/ml。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述纤维蛋白原比调节剂的质量比为约4:1。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述调节剂是2臂、4臂或8臂PEG。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述PEG是4-臂琥珀酰亚胺基戊二酸酯封端的聚(环氧乙烷)。

16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，所述凝血酶的浓度为3.125IU/ml至12.5IU/ml。

17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述凝血酶是人凝血酶。

18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中形成支持基质的步骤包括在模具中形成所述支持基质。

19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中步骤b)包括在补充有人血清(0.5–5％)、人血浆裂解物(0.5-5％)、人血清白蛋白(0.5-5％)、L-抗坏血酸(例如10-100ug/ml)、氢化可的松(例如50-500ng/ml)、碱性成纤维细胞生长因子(例如1-20ng/ml)、硒(例如1-10ng/ml)、乙醇胺(例如1-10ug/ml)、胰岛素(例如1-20ug/ml)、转铁蛋白(例如1-10ug/ml)和抑肽酶(例如10-100KIU/ml)的培养基中孵育支持基质。