[发明专利]废水中病原体的检测

说明书

提供了从废水中浓缩RNA并通过数字扩增对所述RNA进行定量的方法。

相关申请交叉引用

本专利申请要求于2020年10月21日提交的美国临时专利申请第63/094,753号的优先权，所述美国临时专利申请出于所有目的通过引用并入。

背景技术

检测废水(例如，源自人类或其它动物的污水或其它流出物)中的病原体可以提供有关特定病原体流行率的有用流行病学信息，从而改变调控疾病传播的政策或程序。最近描述了检测废水中病原体的实例，所述实例针对导致COVID-19的SARS-CoV-2病毒。参见例如，Peccia等人，《自然生物技术(Nature Biotechnology)》第38卷，第1164-1167页(2020)。

废水中含有大量的分子生物学操作工具抑制剂。值得注意的是，废水中存在的抑制剂可能会损害聚合酶活性。以前，RNA提取已经克服了这个问题，即通过有机(例如，苯酚)提取将废水中的RNA与其它组分分离。

发明内容

所述方法的各方面可以在本文的其它地方找到。在一些实施例中，提供了检测废水中的RNA的方法。在一些实施例中，所述方法包括提供包括含RNA的废水的样品；将所述样品中的RNA浓缩(例如，至少100倍)以形成浓缩的样品，其中所述浓缩从所述样品中去除颗粒；将所述浓缩的样品分成多个分区；在所述分区中进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)以扩增靶RNA(如果存在的话)，以产生扩增的cDNA；并且检测所述分区中存在或不存在扩增的cDNA，其中所述方法不包括RNA提取。

在一些实施例中，所述方法包括提供包括含病毒体的废水的样品，所述病毒体包括RNA；将所述样品中的病毒体浓缩至少100倍以形成浓缩的样品，其中所述浓缩从所述样品中去除颗粒；将所述浓缩的样品分成多个分区；在所述分区中进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)以扩增来自所述病毒体的靶RNA(如果存在的话)，以产生扩增的cDNA；检测所述分区中存在或不存在扩增的cDNA。

在一些实施例中，所述方法进一步包括基于含有检测到的扩增的cDNA的分区的数量对所述废水中的所述靶RNA或病毒体数量进行定量。

在一些实施例中，所述浓缩包括切向流浓缩。在一些实施例中，所述切向流包括使所述样品流过中空纤维过滤器并且用泡沫洗涤缓冲液提取捕获的颗粒。

在一些实施例中，所述分区是液滴或微孔。

在一些实施例中，所述多个包括至少100个、1000个或10000个分区。

在一些实施例中，所述分区包括荧光探针，所述荧光探针在检测期间与所述扩增的eDNA特异性杂交。在一些实施例中，所述荧光探针是嵌入染料。在一些实施例中，所述荧光探针是水解探针或分子信标。

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。通常，本文所使用的命名法以及下文所描述的细胞培养、分子遗传学、有机化学以及核酸化学与杂交中的实验室程序是本领域中众所周知并且通常采用的那些。标准技术用于核酸和肽合成。技术和程序通常根据本领域的常规方法和各种一般参考文献来执行(通常参见，Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册(MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL)》，第2版(1989)纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)，所述文献通过引用并入本文)，所述常规方法和各种一般参考文献在本文档中通篇提供。本文所用的命名法以及下文所述的分析化学和有机合成中的实验室程序是本领域众所周知和常用的。