[发明专利]用于稳定的台盼蓝溶液的组合物和方法

说明书

提供了用于稳定的台盼蓝溶液的组合物、方法和试剂盒。在一个实例中，方法包括：使台盼蓝溶液冷却；以及过滤经冷却的溶液。在另一个实例中，方法包括：将水溶性聚合物与台盼蓝溶液混合。所述方法还可包括添加一种或更多种成分，例如水性缓冲液、渗透剂、酸、碱、缓冲剂、细胞培养基、水、或其组合。

相关申请的交叉引用

本申请作为PCT国际专利申请于2021年12月3日提交，并要求2020年12月3日提交的名称为“TRYPAN BLUE SOLUTIONS”的美国临时专利申请号63/120,957的权益和优先权，其公开内容通过引用整体在此并入。

背景技术

本公开内容一般性地涉及包含台盼蓝的溶液、制备台盼蓝溶液的试剂盒和方法、用于稳定台盼蓝溶液的方法和使用台盼蓝溶液的方法。

台盼蓝是一种偶氮染料，其具有从纺织品到生物科学的广泛应用。台盼蓝通常用于在染料排斥试验中确定细胞生存力。当将台盼蓝用于染料排斥试验时，具有完整细胞膜的细胞排斥台盼蓝染料并且不被染色。这种未被染色的状态被认为是细胞生存力的指标。相反，具有受损的细胞膜的细胞允许染料摄取，并被染成蓝色。这种染色状态被认为是细胞无生存力的指标。未被染色细胞与总细胞的比率可用于计算给定样品中活细胞的百分比。

染色细胞和未被染色细胞之间的区分通常是通过使用光学显微镜和人工细胞计数装置(例如血细胞计数器)进行视觉检查和计数来实现的。另外，使用成像设备和图像处理算法来自动计数和区分染色细胞和未被染色细胞的分析仪器是可用的。

因为染色细胞和未被染色细胞之间的计数和区分是基于视觉检查或成像处理，所以用于染料排斥试验的染料溶液保持基本上不含可干扰细胞识别的颗粒和其他碎片是很重要的。

磷酸盐缓冲盐水(phosphate-buffered saline，PBS)中的台盼蓝是溶解在PBS中并借助于叠氮化钠进行保存的台盼蓝的溶液。

染料聚集描述了溶解的染料分子之间的自缔合的现象。显著的自缔合可导致染料以包含许多染料分子的不溶性聚集体的形式从溶液中沉淀。这种自缔合是由多种具有吸引力的分子间引力包括氢键、静电相互作用、范德华力和π堆积介导的。

染料缓冲溶液中存在的其他化学物质影响染料分子之间的相互作用。这些影响可提高或降低染料聚集的可能性。将氯化钠添加至染料缓冲液，以确保渗透平衡；在这种溶解盐不存在的情况下，得到的低张缓冲液会促进细胞渗透，并且不适合用于细胞生存力的染料排斥试验。

台盼蓝染料通常包含有机杂质。红色杂质出现在台盼蓝中，其难溶于PBS，并形成丝状或纤维状红色染料聚集体，如图1所示。科学文献先前已经描述了在台盼蓝及其结构类似物的合成过程中这种红色杂质的形成(参见Organic Syntheses 1936，16，12；DOI10.15227/orgsyn.016.0012)。当台盼蓝和红色杂质分别溶解在溶液中时，其在视觉上是不同的。

染料溶液的表面外观(cosmetic appearance)通常会受到存在的杂质聚集体的损害。这些杂质聚集体可能与生物污染物或碎片混淆，并且在其他情况下影响染料溶液产品的感知品质，并可能被不正确地解释。

如果台盼蓝包含大量染料聚集体，可需要进一步过滤或加热，以除去或重新溶解染料聚集体。过滤或加热可能是不切实际的，并且这些方法不能防止在储存温度下，通常在环境实验室温度或接近环境实验室温度下，染料聚集或沉淀的再次发生。因此，需要聚集体减少或没有聚集体的稳定的台盼蓝溶液。

发明内容

在一方面中，本发明提供了台盼蓝溶液。在一个实例中，台盼蓝溶液包含：台盼蓝、渗透剂和水性缓冲液。

在一些实施方案中，台盼蓝溶液可具有基于台盼蓝溶液的总重量(以w/w％为单位)或总体积(以w/v％为单位)的约0.01％至约2％的台盼蓝浓度。缓冲液可以是经叠氮化钠保存的PBS缓冲液。