[发明专利]一种检测寨卡病毒包膜蛋白E的ELISA试剂盒

说明书

本发明提供了一种快速检测寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)包膜蛋白E的ELISA试剂盒，并提供了一种寨卡病毒包膜E蛋白特异性抗原的筛选及特异性抗体的制备方法。该试剂盒包括捕获抗体和与辣根过氧化物酶标记物结合的检测抗体,可特异性检测寨卡病毒包膜蛋白E，与其他黄病毒属病毒,如登革病毒、西尼罗河病毒和乙型脑炎病毒无交叉反应。本发明的检测试剂盒具有快速、灵敏度高、标准化的优点，可对寨卡病毒进行早期体外诊断。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测寨卡病毒包膜蛋白E的ELISA试剂盒。

背景技术

寨卡病毒(zika virus,ZIKV)属于黄病毒科(flaviviridae)黄病毒属(flavivirus)，是一种由蚊子传播的虫媒病病毒,可对人体造成神经性损害，尤其是对孕妇和胎儿造成损害。全球已有数十个国家和地区报告发现ZV本地传播病例，分布在美洲、亚洲、非洲和欧洲，其中巴西、哥伦比亚等国疫情最为严重,我国也已经出现了输入性ZV感染病例，但至今尚无预防性疫苗和特异性抗病毒药物可用于有效预防和控制ZV感染。

ZIKA基因组为单股正链RNA，只有一个开放阅读框(ORF)，编码1个多聚蛋白，在宿主细胞经剪切加工后成为3个结构蛋白，即衣壳蛋白(C)、膜蛋白前体/膜蛋白(prM/M)和包膜蛋白(E)，以及7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)，包膜蛋白E以二聚体形式位于毒粒表面，包含与宿主细胞受体的结合位点和诱导产生特异性抗体的线性和空间构象性B细胞抗原决定簇位点/抗原表位。包膜蛋白E特异性抗体可与包膜蛋白E发生结合作用，因此可利用其来捕获包膜蛋白E，实现检测目的。

目前对寨卡病毒感染的诊断包括逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法，该方法检测血液或尿液样本中的病毒特异性核酸，在寨卡病毒感染急性期，此方法具有较高的特异性和敏感性，但该技术较为繁琐，不易推广。此外还有血清学方法，如免疫荧光分析(IFA)，检测患者血清中的病毒抗原特异性抗体(IgG或IgM)，但易出现假阳性结果。

综上所述,建立一种快速、可靠、标准化的寨卡病毒早期诊断方法非常重要，将会对发现、控制传染源，对于控制疫情起着至关重要的作用。

发明内容

综上所述，为克服现有技术的不足，本发明提供一种操作简单、使用方便、安全有效的检测寨卡病毒包膜蛋白E的ELISA试剂盒。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：筛选获得的特异性高和抗原性强的目的抗原的编码序列，利用昆虫表达系统进行表达，获得重组寨卡病毒包膜蛋白E。技术方案如下：

1.寨卡病毒全长包膜蛋白E的表达纯化

以病毒RNA反转录所获得的cDNA为模板,扩增ZIKVE基因片段，克隆至杆状病毒表达载体，转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，获得正确的杆粒，利用sf9细胞扩增重组杆粒，利用High5细胞进行蛋白表达。

2.特异性抗原的筛选与设计

(1)分析寨卡病毒结构蛋白E目的抗原序列，筛选出特异性高和抗原性强的8条肽段作为单克隆抗体筛选的靶标，所选多肽如下所示：

Pep1：RDFVEGMSGGTW

Pep2：MAQDKPTVDI

Pep3：SISDMASDSRCPTQGEAYLDKQSDTQYV

Pep4：CTAAFTFTKIPAETLHG

Pep5：KIPAETLHG

Pep6：DTAWDFGSVGGALN

Pep7：HRSGSTIGKAFEAT

Pep8：TVEVQYAGTDGPCKVPA