[发明专利]一种红鳍原鲌放流评价方法

权利要求书

1.一种红鳍原鲌放流评价方法，其特征在于，所述全生物降解吹膜材料的原料按重量份计为：

S1、采集被放流红鳍原鲌亲鱼的鳍条，保存于酒精内；

S2、回捕各放流洄游点的红鳍原鲌个体，并取每个个体的鳍条；

S3、提取所有鳍条样本的红鳍原鲌DNA；

S4、采用5组双重PCR微卫星引物检测回捕的红鳍原鲌个体和被放流红鳍原鲌亲鱼的亲子关系。

2.根据权利要求1所述的一种红鳍原鲌放流评价方法，其特征在于：所述S3中红鳍原鲌DNA的提取包括以下步骤：

A1、消化准备：清洗工具，取固定于无水乙醇中的样品50～100mg，用去离子水浸泡20min，出去酒精，重复三次，新鲜组织样品可省略此步骤；

A2、消化：剪碎样品，置于1.5ml离心管中，加入200μLDNA裂解液，5μL蛋白酶K(10mg/mL)，略离心，颠倒混匀，放入50℃～55℃水浴锅消化3～5h，直至裂解液澄清；

A3、抽提：按照体积比为25：24：1的比例加入酚：氯仿：异戊醇200μL，颠倒晃动15～20min，8000rpm离心5min，吸出上清液，置于新的1.5mL离心管中，重复三次；

A4、沉淀：加入-20℃预冷的无水乙醇800μL，若产生絮状沉淀，则为纯度较高的DNA样品，可挑出待用，12000rpm离心15min，倒掉上清液，加入75％的酒精400～800μL清洗沉淀，12000rpm离心5min，倒掉上清液，用滤纸略吸水，室温放置约2～5h晾干；

A5、溶解：加入ddWater100～200μL，涡旋振荡仪震荡10s，使其溶解，略离心，4℃静置1d以上，使其充分混匀；

A6、检测：1％琼脂糖凝胶电泳检验DNA的完整性，并用NanoDrop2000紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度；

A7、保存：DNA样品至于-20℃保存，使用时稀释，终浓度为20～50ng/μL。

3.根据权利要求1所述的一种红鳍原鲌放流评价方法，其特征在于：所述S5中的红鳍原鲌微卫星标记的5组双重PCR微卫星引物，具体引物信息如下：

4.根据权利要求1所述的一种红鳍原鲌放流评价方法，其特征在于：所述S5中检测回捕的红鳍原鲌个体和被放流红鳍原鲌亲鱼的亲子关系包括以下步骤：将PCR扩增产物在10％的聚丙烯酰胺胶上进行电泳分离；根据分离结果统计PCR扩增产物的基因型；所述的PCR反应体系是25ul：10×PCRBuffer3ul，2.5mmol/LdNTP2ul，MgCl23ul，上下游引物各1ul，Taq酶0.5ul，DNA模板2ul，超纯水12.5ul。

5.根据权利要求4所述的一种红鳍原鲌放流评价方法，其特征在于：所述的PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

6.根据权利要求1所述的一种红鳍原鲌放流评价方法，其特征在于：所述的红鳍原鲌个体之间亲缘关系远近的测量方法为根据PCR产物的条带大小，使用mega5.0软件和population软件做聚类发育树，根据聚类分析图鉴定个体之间的亲缘关系。