[发明专利]一种高灵敏免标记的肾癌血清检测生物试剂

说明书

本发明公开了一种高灵敏免标记的肾癌血清检测生物试剂，包括11‑巯基十一烷酸溶液(MUA)、磷酸盐缓冲液(PBS)、乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺(EDC)、N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)、牛血清白蛋白(BSA)、抗糖类抗原9(anti‑CD9)。制作方法，其包括如下步骤：步骤一：活化等离激元超表面结构；步骤二：活化MUA；步骤三：偶联抗体；步骤四：封闭未连接抗体的MUA。本发明采用等离激元超表面结构进行外泌体无损传感检测，可实现低至300个/mL外泌体溶液的高灵敏检测，准确性高且操作简单，对患者与健康两组的实验比较采用双样本t检验，P0.001。

技术领域

本发明涉及生物医学检测、体外诊断技术领域，具体为一种高灵敏免标记的肾癌血清检测生物试剂。

背景技术

外泌体是一类特殊的细胞外囊泡(EVs)，大多数细胞分泌的外泌体直径为30-150nm。它们能够充当细胞间通讯的介质。EVs携带几种代表它们细胞起源的膜结合分子和囊内分子。四次跨膜蛋白家族，例如CD63、CD9和CD81，主要用作外泌体标记。肿瘤衍生的EV(T-EV)还表达了多种肿瘤表面标志物，例如上皮细胞粘附分子(Epcam)、表皮生长因子受体(EGFR)和CA125。近年来，利用这些生物标志物追踪体液中的EV/T-EV成为一种非侵入性的癌症液体活检方法，尽管这种潜在的应用前景广阔，但在临床样品中鉴定和定量EV仍然具有挑战性。目前，提纯EVs最常用的方法涉及一系列高速超速离心步骤，这非常耗时，不适用于大量临床样品。

最近的研究结果表明，癌细胞产生的EVs明显多于健康细胞，这些与癌症相关的EVs是用于早期癌症检测和治疗监测的良好的生物标志物。然而，由于其体积小、体液中存在其他成分的复杂背景等，目前尚无临床批准的EV检测准确检测试剂。

发明内容

本发明提供了如下的技术方案：一种高灵敏免标记的肾癌血清检测生物试剂，实现等离激元超表面在血清外泌体检测中的应用。

一种高灵敏免标记的肾癌血清检测生物试剂，其特征在于，包括11-巯基十一烷酸溶液(MUA)、磷酸盐缓冲液(PBS)、乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、牛血清白蛋白(BSA)、抗糖类抗原9(anti-CD9)。

一种高灵敏免标记的肾癌血清检测生物试剂的制作方法，其包括如下步骤：

步骤一：活化等离激元超表面结构：将11-巯基十一烷酸溶液(MUA)加入乙醇溶液，配制得12mmol/L的MUA乙醇溶液，将所述超表面结构放在MUA乙醇溶液中保存4至8小时，形成MUA自组装膜；

步骤二：活化MUA：配制400mmol/L的丙基碳化二亚胺(EDC)溶液和100mmol/L的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，先用去离子水清洗所述步骤一中的等离激元超表面结构，然后用所述400mmol/L的丙基碳化二亚胺(EDC)溶液和100mmol/L的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液将超表面结构浸泡0.5至1.0个小时，活化MUA；

步骤三：偶联抗体：将所述步骤二中的等离激元超表面结构放在40ug/mL的抗糖类抗原9(anti-CD9)溶液中浸泡0.5至1.0个小时，使所述抗糖类抗原9(anti-CD9)溶液中的anti-CD9与所述等离激元超表面结构已活化的MUA结合；

步骤四：封闭未连接抗体的MUA：在所述步骤三中的等离激元超表面结构中加入浓度为1％至3％BSA溶液，封闭未连接抗糖类抗原9(anti-CD9)的MUA。

本发明的有益效果是：采用等离激元超表面结构进行外泌体无损传感检测，可实现低至300个/mL外泌体溶液的高灵敏检测，准确性高且操作简单，对患者与健康两组的实验比较采用双样本t检验，P0.001。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：