[发明专利]一种提高D-生物素产量的生产方法

说明书

本发明涉及一种提高D‑生物素产量的生产方法，属于生物技术领域。本发明公开了一种提高D‑生物素产量的生产方法，该方法是采用易变假单胞菌(Pseudomonas mutabilis)基因工程菌，以葡萄糖和甘油为复合碳源，并采用两阶段或三阶段控温策略，结合乙醇补料工艺进行D‑生物素的快速发酵生产，较原始工艺产量提高了21％‑170％，周期缩短了13％‑28％。本发明提供了一种简便、安全、高效的D‑生物素发酵生产方法，改变了已有生产工艺步骤，显著提高了D‑生物素的生产强度，不仅缩短了发酵周期，节约了成本，而且减少了发酵废液和废气的排放，减轻环境污染，另外，工艺简单易放大，易于实现工业化生产。

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体地涉及一种生产D-生物素的液体发酵方法的改进方法。

背景技术

生物素(Biotin)属于水溶性B族维生素，亦称维生素B₇、维生素H、辅酶 R(Coenzyme R,CoR)，是一种环状结构的物质，具有硫酚(Thiophene)的结构环，此种化学物质有八种同分异构体，但只有右旋生物素(D-生物素)是存在于自然界的，也只有其有维生素的活性。它是动物、植物和微生物营养的必需维生素之一，是羧化和脱羧化反应的辅酶，是合成维生素C的必要物质，是脂肪和蛋白质正常代谢不可或缺的物质，其在维持人和动物正常生长发育、保护皮肤健康、毛发和骨骼健康等方面起到必不可少的作用。因此，在食品、医疗、多维制剂和饲料添加剂行业得以广泛应用。据统计，2010-2018年期间，全球生物素需求量从150吨增长到230吨，年复合增长率为5.49％，其中国内需求增速显著大于国外需求增速。目前，全球市场每年需求量为250吨，并逐年增加。可见， D-生物素具有非常广阔的应用潜力及商业市场前景。

生物素为无色、无臭、长针状结晶物，在普通温度下相当稳定，紫外光下逐渐被破坏，易溶于热水和乙醇中，在弱酸性或弱碱性溶液中较稳定，强酸或强碱中加热则破坏其生物活性。

当前，商业化的D-生物素，大部分仍以化学合成法为主，且工艺主要以 Sternbach合成路线为基础，现行的工业化生产方法在此基础上进行改进。生物素分子结构复杂，具有三个手性中心，合成技术要求高，生产工艺属不对称合成，其合成路线长，对反应的要求高，生产难度极大，壁垒高，且从投料到出品需要一个月左右的时间。

经过检索，截至目前，公布的有关D-生物素制备方法的主要专利有：

1.申请号为85103248的“制备杂环化合物新方法”发明专利，是霍夫曼·拉罗奇有限公司在中国申请的专利，该专利叙述了一种用于制备生物素合成过程中的中间体以及制备生物素本身的方法，在该方法中，通过格利雅反应将侧链连到环状体系上，使得到的化合物脱水，然后使脱水产物基本上还原。

2.申请号为87107807.4的“圆球杆菌的bioA,bioD,bioF,bioC,bioH基因的克隆，载体和转化细胞以及生物素的制备方法”发明专利，是特朗斯吉恩有限公司在中国申请的专利，该专利公开了涉及DNA(脱氧核糖核酸)顺序，它是下列的在细菌中的生物素的生物合成链的基因之一：bioA,bioD,bioF,bioC和bioH基因；包含这些顺序的载体能够转化其它的微生物，以便改进生物素的生产。

3.专利号为ZL 91103221.5的“新的微生物以及利用这些微生物生产生物素同效维生素的方法”的发明专利，是资生堂株式会社在中国申请的专利，该专利公开了一种属于埃希氏杆菌属，芽孢杆菌属和赛氏杆菌属中任一属的突变菌株，该菌株具有的葡萄糖消耗速率至多为相应野生型菌株的四分之一，且其中的生物素反馈抑制途经已去除。该发明还提供了利用该突变菌株生产生物素的方法。

4.申请号为93102377.7的“新的微生物和用所述微生物制备d-生物素的方法”的发明专利，是田边制药株式会社在中国申请的专利，该专利公开了一种新的微生物，其是通过导入掺有沙雷氏菌属的生物素基因的重组质粒并进一步将外源生物素基因整合到染色体中所获得的，以及用所获得的微生物制备d-生物素的方法，包括在培养基中培养微生物并积累d-生物素，最后收集d-生物素。