[发明专利]一种香树脂醇合酶突变体及其应用

说明书

本发明涉及一种定点突变改造的香树脂醇合酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第323位的亮氨酸替换为丙氨酸；或第328位的亮氨酸替换为丙氨酸；或第331位的苯丙氨酸替换为丙氨酸；或第341位的半胱氨酸替换为丙氨酸。本发明构建的香树脂醇合酶突变体通过在解脂耶氏酵母中表达，与出发菌株即未突变菌株相比α‑香树脂醇和β‑香树脂醇的产量均有所提升，其中α‑香树脂醇的产量最多提升12.38倍，β‑香树脂醇的产量最多提产7.99倍。改造后的基因工程菌株，更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。

技术领域：

本发明涉及一种定点突变改造的香树脂醇合酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。

背景技术：

香树脂醇(C₃₀H₅₀O)是一类五环三萜化合物，是植物中丰富的次生代谢产物之一。在自然界中，香树脂醇是以游离或成酯形式存在于植物中的，并有α-香树脂醇和β-香树脂醇两种同分异构体。他们具有广泛的药理活性以及药用价值，包括抗炎、抗菌、抗癌、保护肝脏、提高免疫力等，市场应用价值极高。

本发明的香树脂醇合酶(CrMAS)基因从长春花中获取，通过分子模拟和分子对接预测其有五个关键结合口袋，选择结合力最高的口袋进行后续研究。香树脂醇合酶可以和底物2,3-氧化角鲨烯通过疏水作用结合并同时产生ɑ-香树脂醇和β-香树脂醇。

定点突变是指通过聚合酶链式反应(PCR)的方法向目的DNA片段(质粒或基因组)中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效地提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因工程研究工作中一种非常有用的手段，也是研究蛋白质结构和功能之间复杂关系的有力工具。

发明内容：

本发明提供的技术方案之一，是一种香树脂醇合酶突变体，所述的香树脂醇合酶突变体，是在SEQ ID NO.1所示的野生型香树脂醇合酶基础上，发生如下突变中的至少一种获得的：

(1)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第323位的亮氨酸替换为丙氨酸；或

(2)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第328位的亮氨酸替换为丙氨酸；或

(3)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第331位的苯丙氨酸替换为丙氨酸；或

(4)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第341位的半胱氨酸替换为丙氨酸。

进一步地，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的香树脂醇合酶的第323位亮氨酸替换为丙氨酸时，突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的香树脂醇合酶的第328位亮氨酸替换为丙氨酸时，突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的香树脂醇合酶的第331位苯丙氨酸替换为丙氨酸时，突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步地，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的香树脂醇合酶的第341位半胱氨酸替换为丙氨酸时，突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明提供的技术方案之二，是编码上述香树脂醇合酶突变体的基因；

进一步地，所述香树脂醇合酶突变体具有SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9或SEQ ID NO.10任一所示的编码基因。

本发明提供的技术方案之三，是携带上述基因的重组质粒；

进一步地，所述重组质粒采用的表达质粒包括但不限于pYLEX1、pUG6等。

本发明提供的技术方案之四，是表达上述突变体的重组菌；