[发明专利]一种生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株、方法及应用

权利要求书

1.一种生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株，其特征在于：所述基因工程藻株是通过将木聚糖酶xynLc9基因整合至集胞藻PCC6803基因组中而获得的一种生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株SPSXC9，所述木聚糖酶xynLc9基因序列为SEQ IDNO.13。

2.根据权利要求1所述的生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株，其特征在于：所述木聚糖酶xynLc9基因来源于枯草芽孢杆菌BacillussubtilisLucky9中，其GeneID为939861。

3.根据权利要求1或2所述的生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株，其特征在于：所述木聚糖酶xynLc9基因整合过程中采用的载体为表达载体PSXC9。

4.根据权利要求3所述的生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株，其特征在于：所述表达载体PSXC9的构建方法如下：

(1)利用PCR技术，以野生集胞藻PCC6803基因组为模板，获得光感启动子兼上游臂基因片段Promoter-up、下游臂片段downstream；以大肠杆菌K12基因组为模板，获得终止子T1T2基因片段，具体步骤为：

以序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为上下游引物，并以野生集胞藻PCC6803基因组为模板；以序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为上下游引物，并以大肠杆菌K12基因组为模板；以序列表中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为上下游引物，并以野生集胞藻PCC6803基因组为模板；分别通过PCR扩增技术获得光感启动子兼上游臂基因片段Promoter-up、终止子T1T2基因片段与下游臂片段downstream，获得的片段的序列依次为SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11；

(2)对步骤(1)中所获得终止子T1T2基因片段进行PstⅠ和BamHⅠ双酶切；对步骤(1)中所获得的下游臂片段downstream进行SacⅠ与SacII双酶切；

(3)将pBluescriptSK质粒进行PstⅠ和BamHⅠ双酶切，与步骤(2)制得的终止子T1T2基因片段用T4连接酶连接，得到质粒pBluescriptSKT1T2；然后将步骤(2)制得的downstream基因片段用SacⅠ与SacⅡ双酶切后与经相同酶切的质粒pBluescriptSKT1T2连接，得到质粒P5ST1T2-downstream；

(4)以序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为上下游引物，以枯草芽孢杆菌BacillussubtilisLucky9的基因组为模板，通过PCR扩增技术获得木聚糖酶xynLc9基因片段，序列为SEQ ID NO.13；

(5)用限制性内切酶BamHⅠ处理puc4K质粒，回收获得Kana抗性基因片段，其基因序列为SEQ ID NO.12；

(6)用限制性内切酶BamHⅠ处理质粒载体P5ST1T2-downstream，将步骤(5)所获得的Kana基因片段在连接酶的作用下连接至回收所得的P5ST1T2-downstream载体上，与步骤(1)中所获得的光感启动子兼上游臂基因片段Promoter-up磷酸化之后，进行同源重组，制得质粒载体P5ST1T2npt；

(7)用限制性内切酶ApaⅠ处理质粒P5ST1T2npt，并将步骤(4)所回收木聚糖酶xynLc9基因片段在重组酶的作用下进行同源重组，制得重组表达载体质粒PSXC9。