[发明专利]一种三酮脱氢物的制备方法

说明书

本发明属于甾体激素制备技术领域，具体是涉及一种三酮脱氢物的制备方法，步骤为，将含有3‑甾酮‑1‑脱氢酶的微生物和原料三酮混合，同时加入有表面活性剂、聚醚消泡剂PPE和外源电子受体，不加入有机溶剂，进行微生物发酵，发酵完成后，获得三酮脱氢物，反应路线如下：本发明有效提高产物的转化率，提高收率。

技术领域

本发明属于甾体激素制备技术领域，具体是涉及一种三酮脱氢物的制备方法。

背景技术

目前甾体药物生产常用的方法是利用化学合成和微生物转化相结合的工艺路线，而关键几步反应通常采用微生物转化法实现，其中包括A环C1,2-位脱氢。微生物对甾体的转化是通过微生物体内一种酶或酶系而发挥作用的，而对甾体C1,2-位脱氢起作用的酶叫做3-甾酮-1-脱氢酶(KSDD)，也称为甾体C1,2位脱氢酶。该酶通常存在于诺卡氏菌属(Nocardia sp.)、红球菌属(Rhodococcus sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、分枝杆菌属(Mycobacterum sp.)以及节杆菌属(Arthrobacter sp.)等微生物中。影响甾体生物脱氢转化率的因素除了底物的溶解性外，最大的影响因素是目标微生物酶的活性。因此，怎样提高酶活是甾体脱氢反应的关键点之一。

三酮是甾体药物生产过程中重要的中间产物和原料，三酮C1,2-位脱氢可以有效提高后续产物的抗炎活性，是甾体化合物制备过程中重要的反应之一。三酮脱氢目前主要采用生物转化法完成，但由于底物溶解性差，微生物(酶)活性难以提高等因素的影响，导致转化周期长，转化率低，分离纯化难度较大，收率难以提高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种三酮脱氢物的制备方法，有效提高产物的转化率，提高收率。

本发明的内容包括一种三酮脱氢物的制备方法，步骤为，将含有3-甾酮-1-脱氢酶的微生物和原料三酮混合，同时加入有表面活性剂、聚醚消泡剂PPE和外源电子受体，不加入有机溶剂，进行微生物发酵，发酵完成后，获得三酮脱氢物，反应路线如下：

优选的，所述含有3-甾酮-1-脱氢酶的微生物为简单节杆菌(Arthrobactersimplex)，优选为简单节杆菌(Arthrobacter simplex)CPCC 140451。

简单节杆菌的培养方法为：

(1)斜面培养：所述斜面培养基包括按质量体积百分数(w/v)计的以下物质：葡萄糖0.1-2％，酵母膏0.1-2％，pH 7.0-8.0，琼脂0.5-2％，121℃灭菌30min，接种简单节杆菌菌种。25-32℃恒温培养箱培养1-6天。

(2)一级种子培养：所述一级种子培养基包括按质量百分数(w/v)计的以下物质：葡萄糖0.1-2％，玉米浆0.1-2％，蛋白胨0.1-1％，酵母膏0.1-1％，磷酸二氢钾0.1-1％，pH7.0-8.0。121℃，灭菌30min。无菌条件下接种简单节杆菌斜面菌种，25-32℃，150-250rpm摇床振荡培养10-72h，得到简单节杆菌一级种子培养液。

(3)二级种子培养：所述二级种子培养基包括按质量百分数(w/v)计的以下物质：葡萄糖0.1-2％，玉米浆0.1-2％，蛋白胨0.1-1％，酵母膏0.1-1％，磷酸二氢钾0.1-1％，pH7.0-8.0。121℃，灭菌30min。无菌条件下接种简单节杆菌一级种子，接种量2.5％-30％，25-32℃，50-250rpm摇床振荡培养10-72h，得到简单节杆菌二级种子培养液。

(4)摇瓶转化

在生长好的二级种子中加入三酮、吐温-80、聚醚消泡剂PPE和PMS，其重量浓度分别为0.1-10％三酮，0.01％-0.5％吐温-80，0.1％-5％聚醚消泡剂PPE，0.001％-0.5％PMS。放入摇床25-32℃，50-250rpm进行转化，每24h取样进行TLC及HPLC分析。

(5)1升罐转化