[发明专利]一种常见病原菌及耐药基因组的焦磷酸检测试剂盒及其检测方法和应用

权利要求书

1.一种常见病原菌及耐药基因组的焦磷酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测待测样本中12个耐药菌菌种及耐药基因，包括铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜麦芽窄食单胞菌、大肠埃希氏菌、粪肠球菌、屎肠球菌、KPC基因、OXA-23基因、SHV基因和MecA基因的基因型，所述试剂盒包括扩增引物组、测序引物组、扩增液、扩增酶和测序底物；所述扩增引物组包括：铜绿假单胞菌的扩增引物如序列表SEQID NO.2、SEQ ID NO.3所示；鲍曼假单胞菌的扩增引物如序列表SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示；金黄色葡萄球菌的扩增引物如序列表SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示；肺炎克雷伯氏菌的扩增引物如序列表SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示；嗜麦芽窄食单胞菌的扩增引物如序列表SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19所示；大肠埃希氏菌的扩增引物如序列表SEQ IDNO.22、SEQ ID NO.23所示，粪肠球菌的扩增引物如序列表SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27所示；屎肠球菌的扩增引物如序列表SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31所示；KPC基因的扩增引物如序列表SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35所示；OXA-23基因的扩增引物如序列表SEQ IDNO.38、SEQ ID NO.39所示；SHV基因的扩增引物如序列表SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43所示；MecA基因的扩增引物如序列表SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47所示；所述测序引物组包括：铜绿假单胞菌的测序引物如序列表SEQ ID NO.4所示；鲍曼假单胞菌的测序引物如序列表SEQ ID NO.8所示；金黄色葡萄球菌的测序引物如序列表SEQ ID NO.12所示；肺炎克雷伯氏菌的测序引物如序列表SEQ ID NO.16所示；嗜麦芽窄食单胞菌的测序引物如序列表SEQID NO.20所示；大肠埃希氏菌的测序引物如序列表SEQ ID NO.24所示，粪肠球菌的测序引物如序列表SEQ ID NO.28所示；屎肠球菌的测序引物如序列表SEQ ID NO.32所示；KPC基因的测序引物如序列表SEQ ID NO.36所示；OXA-23基因的测序引物如序列表SEQ ID NO.40所示；SHV基因的测序引物如序列表SEQ ID NO.44所示；MecA基因的测序引物如序列表SEQ IDNO.48所示。

2.根据权利要求1所述的常见病原菌及耐药基因组的焦磷酸检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒反应体系为25μL 体系，反应条件为：预变性温度设为95℃，预变性时间设为5min，变性温度设为95℃，变性时间设为25s，退火温度设为58℃，退火时间设为25s，延伸温度设为72℃，延伸时间设为25s，扩增40个循环，72℃保温5min。

3.根据权利要求1~2任一项所述的常见病原菌及耐药基因组的焦磷酸检测试剂盒，其特征在于，采用所述试剂盒的检测方法包括如下步骤：

a)在洁净的离心管中加入含微珠的结合液40μL，再向管中加入PCR产物20μL， 1100rpm振荡15min；

b)将步骤a）离心管中结合好的混合液，移液器吹打混匀后，转移至纯化柱中，7,000×g离心1min；

c)向纯化柱中加入150μL洗涤缓冲液，7,000×g离心 1min；

d)取出纯化柱，向纯化柱中加入22μL稀释后的变性液工作液，静置5min；

e)取新的洁净离心管，向离心管中加入退火缓冲液6μL，再加入待测序列1μL；

f)将纯化柱插入离心管中，7,000×g 离心1min，离心管收集得到单链产物，弃纯化柱；

g)将 EP 管中的单链产物转移至测序管中，向每个测序管中加入 3μL测序酶和 3μL测序底物；

h)取一个 8排管，自圆滑一端向平端依次加入dATP、dTTP、dGTP、dCTP、待测样本对应的待测序列、ddATP；将排管底部轻轻磕碰桌面，使得碱基平铺在排管底部；

i)焦磷酸测序。

4.根据权利要求3所述的常见病原菌及耐药基因组的焦磷酸检测试剂盒，其特征在于，所述PCR产物的扩增体系中各组分含量分别为：待测样本、阳性对照或空白对照1µL，各上游引物0.5μL，各下游引物0.5μL，扩增酶1μL和扩增液22μL。