[发明专利]棉花脂转运蛋白基因GhFIL在改良棉花纤维品质中的应用

说明书

本发明公开棉花脂转运蛋白基因GhFIL在改良棉花纤维品质中的应用。本发明中的脂转运蛋白GhFIL是棉纤维发育过程中的一个重要基因，它对纤维细胞的伸长具有重要作用。本发明首次报道该基因参与棉花纤维发育过程中的鞘脂运输，并且激活了生长素响应通路。以此基因为靶基因构建正反义植株表达载体进行转基因棉花功能验证，结果表明过表达该基因使纤维中脂肪酸和生长素含量增加，纤维长度、强度显著增加，马克隆值显著降低；而抑制该基因表达使纤维中脂肪酸和生长素含量降低，纤维长度、强度显著降低，马克隆值显著升高。因此，在棉花中过量表达该基因可显著改善棉纤维品质。

技术领域

本发明属于生物技术应用领域，涉及棉花脂转运蛋白基因GhFIL在改良棉花纤维品质中的应用。该棉花脂转运蛋白基因GhFIL ORF全长363bp，编码含120个氨基酸的脂转运蛋白，具有8个保守的半胱氨酸残基，在N端具有典型的信号肽结构，等电点为8.8。通过qRT-PCR分析，发现该基因在纤维伸长期优势表达。该基因在陆地棉(Gossypium hirsutum)李氏超短纤维突变体Li1(G.hirsutum acc.Li1)与纤维发育正常的Li1野生型、陆地棉遗传标准系TM-1(G.hirsutum acc.TM-1)的纤维伸长期均存在显著差异表达，通过PCR技术在TM-1中获得该基因全长ORF序列。利用生物技术明确了该基因参与纤维品质改良及功能特征，结果表明过量表达GhFIL能显著提高棉花纤维品质，转基因棉花材料纤维长度、强度显著增加，马克隆值显著降低。

背景技术

棉花是重要的经济作物，棉纤维是世界上最重要的天然纺织原料。棉纤维是由棉花胚珠外珠被表皮层的单细胞发育分化而来。棉纤维细胞起始分化后持续地伸长，最后其长度可达其直径的1000-3000倍。棉纤维的发育从花期(开花)开始，分为四个不同但相互重叠的阶段：起始分化期、快速伸长期、次生细胞壁合成期和脱水成熟期。

在纤维伸长过程中，脂质和蛋白质的持续合成和运输对于支持液泡和质膜的扩张至关重要。研究表明，脂肪酸与纤维素交替沉积在同心圆细胞壁层中，发育中的纤维细胞从3到20天可以将大部分具有各种极性脂质的葡萄糖纳入细胞壁(Kim et al.,2012)。脂质分析表明极性磷脂类包括磷脂酸(PA)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰甘油(PG)，在纤维伸长期间磷脂含量不断增加，到纤维发育的5-14天达到最高水平后便不断减少。说明磷脂是纤维细胞扩张所必需的。超长链脂肪酸通过上调丝氨酸棕榈酰转移酶促进鞘脂生物合成，在胚珠培养基中添加VLCFAs可显著提高纤维细胞的伸长率(Qin et al.,2007)。在植物中，长链脂肪酸作为膜脂的组成部分，通过不同的代谢途径与质体中的甘油脂结合(Nobusawa et al.,2013；Edstam et al.,2014)。VLCFAs可能转化为磷脂或鞘脂，作为细胞成分的前体或调节目标基因的表达(Wan et al.,2005)。然而，由于新启动的纤维细胞不具备合成大量脂质以实现细胞快速扩张的能力，因此，在纤维伸长过程中，脂质如何从胚珠表皮细胞转移到发育中的纤维细胞尚不清楚。鉴定将脂质从胚珠运输到发育纤维中的因素将有助于阐明相关机制。先前的研究表明，脂质转移蛋白(LTPs)很可能是将磷脂传递给发育中的细胞的候选蛋白(Edstam et al.,2013；Lei et al.,2014；Kader et al.,1996)，因为大多数LTPs在发育组织的表皮中大量表达(Debono et al.,2009；Edstam et al.,2011)。LTPs含有一个疏水囊，能够结合长链脂肪酸(Thoma et al.,1994)，研究表明，植物LTPs参与从内质网(ER)到质膜(PM)的脂质运输，随后从质膜运输到细胞外部(Yeats et al.,2008；Choi et al.,2012；Nielsen et al.,1997)。GPI锚定的脂质转移蛋白(LTPG)属于G型LTP家族，由分泌的N端信号肽(SP)、LTP结构域以及蛋白加工和膜锚定的GPI结构域组成(Edstam et al.,2014)。在植物中，LTPGs参与花序茎表皮的胼胝质沉积和代谢，以及角质层生物合成。AtLTPG1表达降低的拟南芥幼苗其茎表面蜡质负荷减少，表明LTPG参与角质层沉积(Kim et al.,2012)。然而，这些LTPs是否将极性脂质传递给伸长的纤维细胞以及它们的作用仍有待确定。尽管许多研究集中在参与棉纤维伸长激活和抑制的基因/蛋白质的功能鉴定上(Luo et al.,2007；Liu et al.,2015；Tang et al.,2014)，但脂质运输的机制及其影响却很少被研究。目前已有文献报道了一个在发育纤维中高表达的棉花基因GhLTPG1的鉴定和功能特性。抑制GhLTPG1表达使纤维变短，这是由于伸长纤维中脂质含量降低所致(Deng et al.,2016)。磷脂酰肌醇是纤维细胞膜的组成成分，也是棉纤维伸长过程中的重要信号分子。棉纤维中PI的显著增加发生在纤维伸长的早期，表明快速发育的纤维细胞需要大量PI的合成。PI是第二大极性脂类，平均占伸长纤维中总极性脂类的18％。然而，有关鞘脂在伸长纤维中是如何发挥作用尚不清楚。