[发明专利]一种葡聚糖酶突变体及其应用

说明书

一种葡聚糖酶突变体及其应用，是以如SEQ ID NO：1所示的葡聚糖酶BisGlu16B_∆C为母本对氨基酸残基Ala299突变后得到的一种突变体A299W。热稳定性方面，突变体A299W在60℃下的半衰期较野生型延长7.7倍，长达130分钟；pH耐受性方面，突变体A299W在pH7‑pH12之间剩余酶活较野生型提高2.2‑58倍；在催化活力方面，以大麦葡聚糖为底物时，突变体的催化效率较野生型提高94%。这样一种耐热、耐酸碱且高催化的β‑1,3‑1,4‑葡聚糖酶突变体，在啤酒酿造、饲料添加以及生物能源等领域具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及基因工程和酶工程技术领域，涉及一种葡聚糖酶突变体及其应用。

背景技术

β-葡聚糖是植物细胞壁的重要多糖组分，由β-D-葡萄糖残基通过1,3-β-糖苷键和1,4-β-糖苷键连接而成。实现生物质多糖快速降解主要包括两种因素，一是加速纤维素和半纤维素大分子的彼此分离和释放，二是酶将多糖水解为寡糖。β-葡聚糖酶是降解β-葡聚糖的主要酶类，其在工业生产中具有重要应用价值，如在啤酒酿造中添加β-葡聚糖酶可增加啤酒澄清度从而改善啤酒口感，在饲料中添加β-葡聚糖酶可有效降低单胃动物肠道食糜黏度，消除葡聚糖的抗营养作用，提高饲料利用率。

根据切割糖苷键的类型可将β-葡聚糖酶分为以下4种类型：β-1,4-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)、β-1,3-葡聚糖酶(EC 3.2.1.39)、β-1,3(4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6)和β-1,3-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)。其中β-1,3-1,4-葡聚糖酶(下称β-葡聚糖酶)的催化活性最高，可通过特异性切割1,3-键相邻的β-1,4-糖苷键将葡聚糖或地衣多糖降解为以纤维三糖和纤维四糖为主的低聚寡糖，因此具有最广泛的应用价值，然而目前报道的大部分β-葡聚糖酶的热稳定性、pH耐受性和催化活性依旧不能满足工业应用的要求。

提高酶的稳定性(包括热稳定性和pH耐受性)可以有效拓宽酶在工业中的应用范围，同时有助于研究者了解酶结构与稳定性之间内在联系。在实际生产中，谷物内源性β-葡聚糖酶在制麦过程和麦汁糖化过程中会丧失大部分酶活。在饲料制粒过程中β-葡聚糖酶会快速丧失活性。为了满足工业生产的需求，需要通过新酶筛选和蛋白质工程手段对β-葡聚糖酶的稳定性进行改造研究。

发明内容

解决的技术问题：为了解决现有β-1,3-1,4-葡聚糖酶热稳定性差、pH耐受性差等问题，本发明提供一种真菌来源的pH耐受性及热稳定性均提高的葡聚糖酶BisGlu16B_ΔC的突变体A299W及其应用，该突变体具有耐酸碱、耐高温且高催化的特点。

技术方案：一种葡聚糖酶突变体，是以如SEQ ID NO：1所示的葡聚糖酶BisGlu16B_ΔC为母本对氨基酸残基Ala299突变后得到的一种突变体A299W。

氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

编码所述葡聚糖酶突变体的核酸，核酸序列如SEQ ID NO：4所示。

含有上述基因的重组表达载体。

含有上述重组表达载体的菌株。

上述菌株在制备提升热稳定性和pH耐受性的葡聚糖酶突变体中的应用

有益效果：本发明通过以来源于丝状真菌Bispora sp.MEY-1的第16家族木聚糖酶BisGlu16B_ΔC为母本对Ala299位点突变后得到的突变体A299W。具体来讲，通过构建含有该突变体基因的重组菌株，诱导培养后筛选出pH耐受性和热稳定性提高的葡聚糖酶突变体A299W。