[发明专利]猪繁殖与呼吸综合征病毒鉴别检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒鉴别检测试剂盒，其包含核酸提取组件、核酸扩增组件和核酸杂交组件，所述核酸杂交组件包含所述基因芯片。本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒鉴别检测试剂盒是首款能够同时鉴别检测猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型、美洲型、美洲型高致病株、美洲型类NADC30株、美洲型类NADC34株的分子生物学检测试剂盒。

技术领域

本发明属于动物传染病病原体分子检测技术领域，具体涉及一种能够检测并鉴别不同猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株包括欧洲型、美洲型、美洲型高致病株、美洲型类NADC30株、美洲型类NADC34株的鉴别检测试剂盒及其应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征俗称猪蓝耳病，是我国《一、二、三类动物疫病病种名录》中规定的二类动物疫病，其是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductive andrespiratory syndrome virus, PRRSV）引起的一种高度接触性传染病，主要怀孕母猪早产、流产、死胎以及仔猪的呼吸道系统症状。

近年来，PRRSV在流行过程中不断演化重组，出现了多种新的流行毒株，例如欧洲型、美洲型经典株、美洲型高致病株、美洲型类NADC30株、美洲型类NADC34株等，不同类型的PRRSV的鉴别检测对于动物疫病流行病学调查及防控手段的选择有重要意义。

PRRSV是一种RNA病毒，通常，技术人员会采用荧光RT-PCR法或PCR-电泳法来检测PRRSV病毒的核酸，并通过设计针对不同毒株的特异性引物、探针来对各种类型的毒株进行鉴别。

但是，荧光RT-PCR法通常需要使用特异性Taqman水解探针，需要鉴别的毒株类型越多，所使用的特异性Taqman水解探针就越多，势必增加探针之间的相互干扰，影响检测的灵敏度。而且，不同探针需要用不同颜色的荧光信号加以识别，探针种类的增加要求荧光PCR仪具有更多的荧光检测通道，而实际上在广大基层检测实验室普遍配置的荧光PCR仪中双通道荧光PCR仪占绝大多数，四通道以上的荧光PCR仪价格昂贵，并不适合在基层推广。电泳法虽然不需要使用荧光探针，但是其只能通过分析片段大小区分来自不同毒株的扩增产物，当这些扩增产物大小接近时则无法加以区分，因而分辨率低。而且，电泳法还存在下述问题：容易受非特异性扩增产物的干扰、特异性差；荧光染料的背景强导致信噪比低、检测灵敏度低。

此外，基因芯片已经应用于分子生物学检测领域。所述基因芯片是将目标序列特异性的核酸探针固定在固相基质反应孔中的特定位置以形成微阵列，在对生物样品进行核酸提取和核酸扩增后，将核酸扩增产物与基因芯片共同温育，使得目标序列的扩增产物与基因芯片的特定位置上的特异性核酸探针杂交形成核酸杂交产物，然后清洗去除未杂交的扩增产物，并使所述基因芯片的特定位置上的核酸杂交产物产生可识读的信号(化学显色、化学发光等)，从而能够判定是否存在与所述特异性核酸探针杂交的核酸扩增产物。与荧光RT-PCR法相比，基因芯片法通过特定位置来区分不同核酸探针，无需对不同核酸探针进行不同颜色的荧光标记，甚至无需使用荧光PCR仪器，因此不存在荧光探针之间相互干扰的问题，也不存在需要匹配昂贵的检测仪器的问题。与电泳法相比，基因芯片法的分辨率和检测灵敏度都明显更高。

但是，即使采用基因芯片法，对于上述这么多种类型的PRRSV毒株的鉴别检测而言，仍然存在下述技术难点：PRRSV不同毒株之间有区别的基因序列往往是高度变异的，这造成了一组扩增引物/核酸探针难以覆盖一种毒株的各种变异，而如果增加针对每一种毒株的引物/探针的数量，必然造成体系整体的复杂度增大，体系的各成分之间相互干扰，从而导致检测的灵敏度和特异性降低。

总之，目前尚无能够区分上述PRRSV毒株的核酸检测试剂盒问世。

鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种只进行一次RT-PCR扩增反应就能够检测并鉴别欧洲型、美洲型、美洲型高致病株、美洲型类NADC30株、美洲型类NADC34株等不同猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株的方法和检测试剂盒、以及该鉴别检测试剂盒的应用。

发明内容