[发明专利]一种微滴式数字PCR荧光信号处理方法

说明书

本发明公开了一种微滴式数字PCR荧光信号处理方法，包括：对原始荧光信号进行滤波得到第一荧光信号；基于第一荧光信号识别微滴参数；基于微滴参数和预设微滴过滤条件过滤微滴；对过滤后的微滴进行聚类从而得到第一阈值；基于第一阈值统计阴性微滴和阳性微滴的个数，并计算待测物的浓度。本发明提出的一种微滴式数字PCR荧光信号处理方法，可以准确地从荧光信号中提取出微滴信号、并准确的区分阴性微滴和阳性微滴，从而实现了样品浓度的准确计算。

技术领域

本发明涉及一种PCR分析技术，具体的涉及一种微滴式数字PCR荧光信号处理方法。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究。数字PCR是近年来发展迅速的新一代定量PCR分析技术，利用微流控技术将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有至少一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。与传统的荧光定量PCR相比，具有高灵敏度、高特异性、无需标准定量曲线等优点。将液滴微流控技术应用在生化分析领域，常使用荧光标记感兴趣的细胞或分子，通过识别带荧光液滴检测样品中待测物浓度。因此准确地从荧光信号中提取出微滴信号、并准确的区分阴性微滴和阳性微滴至关重要。

发明内容

本发明提供了一种微滴式数字PCR荧光信号处理方法，可以准确的从荧光信号中提取微滴信号，准确的区分阴性微滴和阳性微滴，从而实现了样品浓度的准确计算。

本发明克服其技术问题所采用的技术方案是：本发明提出的一种微滴式数字PCR荧光信号处理方法，包括对原始荧光信号进行滤波得到第一荧光信号；基于第一荧光信号识别微滴参数；基于微滴参数和预设微滴过滤条件过滤微滴；对过滤后的微滴进行聚类从而得到第一阈值；基于第一阈值统计阴性微滴和阳性微滴的个数，并计算待测物的浓度。

进一步的，所述对原始荧光信号进行滤波得到第一荧光信号，具体包括：基于预设采样数量采集原始荧光信号，若采集得到的信号的标准差大于预设标准差阈值，则采用小波滤波器对原始荧光信号进行滤波得到第一荧光信号，若采集得到的信号的标准差小于等于预设标准差阈值，则采用高斯滤波器对原始荧光信号进行滤波得到第一荧光信号。

进一步的，所述基于第一荧光信号识别微滴参数，具体包括：对第一荧光信号进行本底估计得到本底值；基于预设偏差和本底值进行第一荧光信号波峰定位；基于波峰确定微滴荧光强度和波峰距离，从而得到至少包括微滴体积和微滴间距的微滴参数。

进一步的，所述对第一荧光信号进行本底估计得到本底值，具体包括：构建第一荧光信号数据的第一直方图；将直方图中最大的频数对应的荧光强度值作为本底信号的荧光强度均值μ，则得到偏差R＝μ-F_min，其中，Fmin为所有荧光强度的最小值；对在[μ-R，μ+R]区间内的荧光数据进行线性拟合得到参数a和b，则位置T处的本底值为F_b＝aT+b。

进一步的，基于预设长度将第一荧光信号分为若干段，对每段的荧光信号分别构建直方图；对每个直方图进行平滑处理；将每个直方图中最大频数对应的荧光强度值为对应的每段信号的本底值。

进一步的，所述基于预设偏差和本底值进行第一荧光信号波峰定位，具体包括：基于本底值和预设偏差，将第一荧光信号分为若干信号段，每个信号段中的最大值为波峰。

进一步的，还包括对波峰进行曲线拟合，具体包括：基于预设个数N选取波峰位置前后各N个荧光强度值,将取值顺序和荧光强度值组成2N+1个坐标点，并进行二次曲线拟合或高斯曲线拟合。