[发明专利]基于酶DNA修复级联驱动荧光团编码/去编码的生物传感器及其在端粒酶检测中的应用

说明书

本发明提供基于酶DNA修复级联驱动荧光团编码/去编码的生物传感器及其在端粒酶检测中的应用，属于荧光检测技术领域。所述生物传感器至少包括AP探针，TS引物，无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶(APE1)，荧光基团修饰的dATP，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)以及链霉亲和素包被的磁珠。采用本发明生物传感器进行端粒酶检测，可以有效防止非特异性扩展，降低背景信号，使用基于全内反射荧光(TIRF)的单分子检测进行定量，可以实现在单细胞水平灵敏检测端粒酶，从而使其在早期临床诊断和抗癌药物开发等方面具有巨大潜力，因此具有良好的实际应用之价值。

技术领域

本发明属于荧光检测技术领域，具体涉及基于酶DNA修复级联驱动荧光团编码/去编码的生物传感器及其在端粒酶检测中的应用。

背景技术

本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

端粒是位于染色体末端的特殊的非编码串联DNA重复序列(TTAGGG)n结构，随着细胞的分裂逐渐缩短，会导致基因组不稳定和细胞衰老。人类端粒酶是一种重要的核糖核蛋白，通过在端粒的3′端添加端粒重复序列5-(TTAGGG)n来维持端粒长度和细胞分裂潜能。端粒酶由人端粒酶RNA(hTER)、端粒酶相关蛋白(hTEP1)和人端粒酶逆转录酶(hTERT)组成，其中hTERT在端粒酶的合成功能中起着决定性作用，是端粒酶活性的限制因素。在大多数人体细胞中，端粒酶的表达水平极低，但是在癌细胞中，例如胃癌、肺癌和肝癌等超过85％的癌细胞，端粒酶具有很高的表达，由于端粒酶活性在正常体细胞和癌细胞之间存在显著差异，端粒酶已被视为早期癌症诊断和预测的重要生物标志物。同时，随着端粒酶抑制剂和靶向抗癌剂的发展，抑制端粒酶活性被认为是一种很有前途的癌症治疗方法。因此，准确、快速、灵敏地检测端粒酶活性对生物医学研究、临床诊断和癌症治疗具有重要意义。

近几十年来，端粒酶检测方法层出不穷，其中最经典的方法是基于聚合酶链反应(PCR)的端粒重复序列扩增方案(TRAP)，它广泛用于端粒酶活性的高灵敏度检测。然而，这个经典的方法具有程序复杂、聚合酶活性受到细胞提取物的干扰以及无法避免的产生非特异性扩增的缺点。

为了优化复杂的实验程序，人们开发出了一些比经典方法更简单的检测端粒酶的方法，如：基于DNA镊子的荧光法、基于链位移的比率荧光法、基于氧化石墨烯的荧光法和基于单分散金纳米棒的电化学生物传感器。这些方法不仅能够更加快速简便的检测端粒酶，而且一些方法还具有能够确定端粒酶反应产物长度分布或同时检测端粒酶和其他生物标记物的优势。然而，这些分析方法涉及繁琐的纳米材料合成、复杂的探针设计，并且由于缺乏信号放大过程，因此这些方法的灵敏度不令人满意。

为了提高灵敏度，人们开发出了一系列与信号放大策略相结合的方法，如：催化发夹组装(CHA)、指数等温扩增反应(EXPAR)、核酸外切酶辅助信号扩增(EASA)、滚环扩增(RCA)和杂交链式反应(HCR)。这些方法改善了之前方法所存在的不足，具有良好的灵敏度和特异性，但是这些方法依赖于严格的序列要求、温和的反应条件和复杂的表面改性过程。此外，值得注意的是聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、指数等温扩增反应(EXPAR)是模板依赖性扩增，而核酸外切酶辅助信号扩增(EASA)、催化发夹组装(CHA)以及杂交链式反应(HCR)依赖于DNA探针序列，它们的扩增过程也表现出模板依赖性，这导致非特异性扩增产生的扩增子交叉污染产生不可避免的假阳性信号。因此，开发一种用于端粒酶检测的具有高灵敏度和低模板依赖性的简单信号放大分析方法成为本领域研究人员亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明提供一种基于酶DNA修复级联驱动荧光团编码/去编码的生物传感器及其在端粒酶检测中的应用。本发明基于端粒定向级联DNA修复介导的荧光团编码/解码，开发一种用于敏感检测端粒酶的模板独立的生物传感器以及相应单分子分析方法，从而有效防止非特异性扩展，降低背景信号，使用基于全内反射荧光(TIRF)的单分子检测进行定量，从而可以实现在单细胞水平灵敏检测端粒酶，因此具有良好的实际应用之价值。