[发明专利]一种病毒纯化高效保护试剂及其应用

说明书

本发明公开了一种病毒纯化高效保护试剂及其应用，病毒纯化高效保护试剂包括的组分及含量为：0.5‑1M蔗糖、20‑30g/L精氨酸、15‑20g/L甘氨酸、15‑20g/L甘露醇、35‑40g/L海藻糖、0.4‑0.5M MgCl₂、0.5M Tris‑HCl，其余为超纯水，pH为7.5。本发明的病毒纯化高效保护试剂，在病毒层析纯化的过程中，在平衡阶段、上样阶段和洗脱阶段，通过添加本发明的病毒纯化高效保护试剂，能对AAV病毒或其他病毒进行保护，避免AAV或其他病毒的蛋白外壳在层析纯化中因条件发生剧烈变化导致蛋白构象改变而影响AAV或其它类病毒的活性和产量。

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，特别是一种病毒纯化高效保护试剂。

背景技术

现有技术中病毒的纯化主要有两种方法，分别是密度梯度离心和层析纯化。密度梯度离心多采用氯化铯或碘克沙醇进行密度梯度离心，但梯度离心法用于中试放大和GMP生产时面临成本高、耗时久等诸多困难。层析纯化法中，多采用亲和层析、离子层析。离子层析的过高或偏低离子浓度均会影响到AAV的电荷，会影响到AAV的蛋白的折叠导致构象发生改变，甚至引起蛋白变性，失去活性。

对腺相关病毒(AAV)进行亲和层析时，往往采用pH2.5-3的洗脱缓冲液，而AAV的蛋白的稳定保存对pH值要求阈值比较小，当pH从7逐渐变为4的过程中，AAV的VP1蛋白的α螺旋发生可逆的结构构象改变，进而影响AAV的生物活性。缓冲液中离子浓度偏低会引起AAV的蛋白聚集成团，也会影响AAV的生物活性。

空壳AAV中缺失部分或全部目标基因片段，属于纯化中需要去除的杂质之一。但是空壳AAV与实心AAV的物理特性差异较小，仅能根据空壳AAV和实心AAV的微小电荷差异进行分离，层析过程中需要采用极端的pH值或离子浓度进行洗脱，极端的缓冲液环境会改变AAV的蛋白的结构，导致AAV的蛋白脱酰胺、被氧化使得AAV失活，进而影响实心AAV的纯化收率。

发明内容

本发明的第一个目的在于针对背景技术中所述的现有技术中，对腺相关病毒(AAV)进行亲和层析时存在的影响AAV的生物活性以及在去除空壳AAV时也会使得实心AAV失活，影响实心AAV的纯化收率的问题，提供一种能够解决前述问题的病毒纯化高效保护试剂。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：其包括的组分及含量为：其包括的组分及含量为：0.5-1M蔗糖、20-30g/L精氨酸、15-20g/L甘氨酸、15-20g/L甘露醇、35-40g/L海藻糖、0.4-0.5M MgCl₂、0.5M Tris-HCl，其余为超纯水，pH为7.5。

本发明的第二个目的在于提供一种的病毒纯化高效保护试剂在病毒纯化中的应用，上述的病毒纯化高效保护试剂用于层析纯化法中的平衡阶段，在层析平衡缓冲液中添加1%-2%病毒纯化高效保护试剂，层析柱平衡时保护AAV蛋白免于因PH值或离子浓度引起的蛋白变性。

本发明的第三个目的在于提供一种上述的病毒纯化高效保护试剂在病毒纯化中的应用，上述的病毒纯化高效保护试剂用于层析纯化法的亲和层析的上样阶段，上样样品中添加1%-2%的病毒纯化高效保护试剂，防止样品中AAV或其它病毒的蛋白外壳变性、聚集和氧化。

本发明的第四个目的在于提供一种上述的病毒纯化高效保护试剂在病毒纯化中的应用，上述的病毒纯化高效保护试剂用于层析纯化法的洗脱阶段，在层析洗脱液中添加1%-2%的病毒纯化高效保护试剂，洗脱时能避免极端PH值导致AAV变性失去生物活性，提高实心AAV/空壳AAV比例，提高AAV产量。