[发明专利]一种检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒及其使用方法

说明书

本发明属于基因测序领域，涉及一种检测人HLA‑I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒，包含：用于cDNA合成的逆转录试剂；用于HLA‑I/II类基因捕获的HLA Target Mix1；用于HLA‑I/II类基因捕获的HLA Target Mix2；用于HLA‑I/II类基因捕获的PCR试剂；用于捕获后DNA文库构建的试剂。本发明还提供了一种上述试剂盒的使用方法：RNA逆转录合成cDNA及纯化；HLA靶向第一次富集及纯化；HLA靶向第一次富集及纯化所得产物的第二次富集及片段分选；捕获文库构建。本发明的试剂盒及使用方法，能够更加真实地评估细胞的免疫状态；方法简单有效，流程稳定。

技术领域

本发明属于基因测序领域，具体涉及一种检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒及其使用方法。

背景技术

测序法已经成为一种常规的实验技术，最近新一代测序技术的显著优势，主要有以下几种：大规模平行签名测序（Massively Parallel Signature Sequencing，MPSS)、高通量测序技术、聚合酶克隆（Polony Sequencing）、454焦磷酸测序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序（Ionsemiconductor sequencing）、DNA纳米球测序（DNA nanoball sequencing）等。

主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）是一组编码动物主要组织相容性抗原的基因群的统称。1958年Dausset等发现，多次接受输血的患者、多产妇和用同种白细胞免疫的志愿者血清中，存在不同特异性的白细胞抗体，用这些抗体鉴定出许多不同特异性的白细胞抗原，称为人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）。通过家系和人群遗传分析发现，人类MHC位于第6号染色体上，称为HLA复合体。MHC可以分为经典MHC与非经典MHC两类，经典MHC包括MHC Ⅰ、MHC Ⅱ、MHC Ⅲ基因，分别编码MHC Ⅰ分子、MHC Ⅱ分子、MHC Ⅲ分子。

MHC class Ⅰ（MHC Ⅰ）：位于一般细胞表面上，可以提供一般细胞内的一些状况，比如该细胞遭受病毒感染，则将病毒外膜碎片之氨基酸链（peptide）透过MHC提示在细胞外侧，可以供杀手CD8+ T细胞等辨识，以进行扑杀。Ⅰ类基因区包括HLA-A、B、C位点的等位基因，编码HLA-A抗原、B抗原和C抗原等经典的Ⅰ类抗原（分子）。

MHC class Ⅱ（MHC Ⅱ）：大多位于抗原提呈细胞（APC)上，如巨噬细胞等。这类提供则是细胞外部的情况，像是组织中有细菌侵入，则巨噬细胞进行吞食后，把细菌碎片利用MHC提示给辅助T细胞，启动免疫反应。Ⅱ类基因区十分复杂，主要包括HLA-DP、DQ、DR三个亚区和新近确定的DN、DO、DM等3个亚区。

MHC class Ⅲ (MHC Ⅲ) ：主要编码补体成分，肿瘤坏死因子（TNF），热休克蛋白70（HSP70)和21羟化酶基因（CYP21A和CYP21B)。Ⅲ类基因区内已定位的至少有36个基因，其中与免疫系统有关的基因有C4B、C4A、C2、Bf、肿瘤坏死因子（TNFA、TNFB）和热休克蛋白70(HSP70），分别编码C4、C2、B因子、TNF-α、TNF-β和HSP70分子。

针对MHC的研究，目前主要集中在针对bulk MHC的I类和II类两个方面。然而，查阅相关试剂盒，仅发现能够检测MHC的某一部分试剂盒，例如专利CN101892317B中描述的I类A基因的2-4外显子、B基因的2-4外显子和DRB1基因的2号外显子；专利CN105039332B描述的I类A、B、C三个基因的全长。结合大量文献研究，HLA的I类基因多态性显著，在1-7号外显子上都显示出基因的多态性；II类集中在DRB1、DRA1、DPA1、DPB1、DQA1、DQB1六个基因的2-4号外显子。目前，尚未发现有此类高范围bulk MHC转录本的试剂盒的出现。

发明内容