[发明专利]一种驱虫斑鸠菊地上部位组织中内生真菌的分离纯化方法及其用途

权利要求书

1.一种驱虫斑鸠菊地上部位组织中内生真菌的分离纯化方法，其特征，按下列步骤进行：

a、前处理及组织液的获取：选用新疆和田地区的驱虫斑鸠菊的花、茎、叶分别用水清洗泥土后，使用蒸馏水冲洗6次，并依次浓度为70%乙醇浸泡1-2 min、浓度为5.25%次氯酸钠浸泡2-5 min和浓度为70%乙醇浸泡30-60s，再用蒸馏水冲洗，将冲洗后的花、茎、叶各部位取2g并压碎获得组织液，再分别加入2-3 mL蒸馏水，各孵化3 min，得到组织液；

b、选择氯霉素100μg/mL 作为抗菌剂；

c、选择固体培养基PDA由马铃薯提取物4 g/L、葡萄糖20g/L和琼脂15 g/L组成，pH为6.0；

d、将步骤c中的培养基PDA经温度120℃高压灭菌20 min，加入步骤b中的抗菌剂混合，倒入平板培养皿中，再加入步骤a得到的花、茎、叶各部位组织液100µL，在温度28℃下培养7-10天，得到粗纯化真菌；

e、培养后在培养基平板上划线不同颜色、形状和浓度的菌落，利用培养基PDA培养1周，对不同颜色、形状和大小的均匀菌落用于DNA分离，得到9种植物内生真菌，分别是Aspergillus terreus NR-01、Trichoderma harzianum NR-02、 Ovatospora senegalensis NR-03、Chaetomium globosum NR-04、Thielavia subthermophila NR-06、Thielavia microspore NR-08、Aspergillus calidoustus NR-10、Mucor circinelloidesNR-11 和 Aspergillus sp. NR-12，利用DNA基因序列对内生真菌进行鉴定。

2.根据权利要求1所述方法获得的内生真菌在制备抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌中的用途。

3.根据权利要求1所述方法获得的内生真菌在促进黑色素中的用途。