[发明专利]一种蓝藻抗生素异质耐药性及其稳定性的检测方法

说明书

本发明公开了一种蓝藻抗生素异质耐药性及其稳定性的检测方法，蓝藻抗生素异质耐药性包括采用梯度浓度的抗生素分别培养目标种属样品，通过微量稀释法分别测得每份目标种属样品的抗生素最低抑制浓度，取其中的最低值计为目标种属的群落MIC；取浓度为群落MIC的0、1、n倍的抗生素分别培养待测蓝藻，其中2≤n≤8，统计各组蓝藻的细胞个数，并分别记作P₀、P₁、P_n；若P_n＜(10％～50％)P₀，则通过以下公式计算待测蓝藻的抗生素异质耐药性水平f：本发明有效降低了对含有少量耐药亚菌群的蓝藻群落的假阴性误判概率，规避了传统最小抑制浓度(MIC)测试方法对抗生素耐药性水平的低估。

技术领域

本发明涉及一种耐药性及其稳定性的检测方法，尤其涉及一种蓝藻抗生素异质耐药性及其稳定性的检测方法。

背景技术

近年来抗生素的大量生产、过量使用和处置排放缺乏有效监管导致河湖水体中抗生素检出率不断上升，河湖水体已成为巨大的抗生素和耐药基因库。低浓度抗生素的长期暴露不可避免地会通过基因突变诱导、水平传递和代际遗传的方式促使细菌耐药性扩散蔓延，抗生素抗性基因通过水生食物链遗传扩增并逐级传递给甲壳纲类、鱼类等可食用水产品，不仅降低水产养殖病害防治效果，还通过饮水、食用水产品和农产品回到人体内，促使细菌尤其是致病菌的耐药性进一步增加，导致抗生素治疗效能逐渐降低甚至消失，轻则医疗时间延长、费用增加，重则可能无药可治，甚至出现生命危险，严重威胁人类健康和社会稳定。

蓝藻又称蓝细菌，具有与革兰氏阴性细菌相似的细胞结构特点和遗传学特性，既是水生态系统平衡和水环境演变的重要指示物种，也是水生态系统中抗生素耐药基因的重要载体和传播中转站，其抗生素耐药性通常可作为评价河湖水体抗生素及耐药基因污染水平的重要依据。蓝藻的表型和基因型耐药性已被广泛检出，通过自身抗性、抗生素压力下基因突变和外源耐药基因转导等方式对一些抗生素表现低敏感性，其表型和基因型耐药性通常呈显著正相关性。但是，部分蓝藻样品呈现较高的基因型抗性水平的同时，在最小抑制浓度(MIC)测试中往往表现出抗生素的表型敏感性。目前学界普遍认为最小抑制浓度(MIC)是细菌敏感或者耐药的判断标准。MIC数据通常是在有利于抗生素灭菌或抑菌作用的条件下获得的，其测试时培养基上细菌生长密度低、处于指数生长阶段且添加抗生素时间较短。然而，基于MIC标准被分类为敏感型的致病菌在长期暴露于抗生素之后可能会表现出耐药性，其中一个很重要的原因就是细菌的抗生素异质耐药性。

抗生素异质耐药性(antibiotic heteroresistance)通常是指某个单一分离的菌株，在其培养的群体中存在着对抗生素敏感性不同的亚群，也即有些细胞对抗生素敏感，而另一些细胞则存在耐药性，此时便称该细菌为抗生素异质性耐药菌株。这些对抗生素敏感性不同亚群的蓝藻细胞数量较少，难以被MIC数据所反映，然而在长期的抗生素选择下这些本是少数的亚群可能成为主要类群，而不稳定的异质耐药性更会加剧蓝藻抗生素耐药假阴性的隐蔽程度。蓝藻异质耐药性降低了实验室蓝藻菌株MIC数据的可靠性，可能造成对河湖水环境抗生素耐药性水平的低估，为蓝藻环境样品的抗生素耐药性评估带来了严峻挑战。

尽管抗生素异质耐药性这一现象早已被国内外相关研究发现，针对临床中所使用抗生素的细菌异质耐药性出现频次及其对于抗生素治疗失败的相对贡献仍然所知甚少。目前关于蓝藻抗生素异质耐药性的研究相对缺乏，主要是由于两个原因，一个是蓝藻抗生素异质耐药性及其稳定性定义及鉴别方法论的模糊，另一个是蓝藻菌株的MIC折点目前尚无准确的数据库，临床测试抗生素敏感度的方法用于检测蓝藻异质耐药性仍是十分困难的。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种高效经济、降低假阴性误判概率的蓝藻抗生素异质耐药性的检测方法；本发明的另一目的是提供一种蓝藻抗生素异质耐药性的稳定性的检测方法。

技术方案：本发明的蓝藻抗生素异质耐药性的检测方法，包括以下步骤：