[发明专利]深海链霉菌基因工程突变株生产怡莱霉素E的高产培养基及其规模化发酵工艺

说明书

本发明公开了一种利用深海链霉菌SCSIO ZH16生产怡莱霉素E的高产培养基，包括如下重量份的组分：可溶性淀粉96g‑144g、黄豆粉16‑24g、玉米浆1.92‑2.88g、氯化钠4.8‑7.2g、硝酸钠7.68‑11.52g、硫酸铵5.12‑7.68g、磷酸二氢钾0.192‑0.288g、以去离子水溶解，并定容至1000mL，用3M氢氧化钠溶液调节pH至7.2‑7.4后，加入1.53‑17.67g碳酸钙。本发明还公开了利用所述的高产培养基发酵生产怡莱霉素E的规模化发酵工艺。本发明的高产培养基，原料易得，价格低廉，有利于推广应用。且可以提高怡莱霉素E的产量。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，是关于一种深海链霉菌基因工程突变株生产怡莱霉素E的高产培养基及其规模化发酵工艺。

背景技术

深海具有复杂而独特的环境，与浅海相比，在光照，氧气浓度，压力，可用养分，盐度和温度方面变化极大，是挖掘海洋稀有放线菌资源和结构复杂多样的次生代谢产物的重要源泉。深海独特的环境促使深海生物形成了独特的生理代谢能力，这不仅保证了它们的生存，而且为其产生新颖的代谢产物提供了潜力。如今，基于其强效的抗菌、抗肿瘤、抗氧化等特性，海洋生物活性化合物在功能性食品和药物的开发中发挥着越来越重要的作用。

深海链霉菌S.atratus SCSIO ZH16(GenBank登录号为KT9708)可以生产一类含有三种非蛋白质氨基酸(N-取代色氨酸、2-氨基-4-己烯酸、和3-硝基酪氨酸)分环七肽家族化合物--怡莱霉素。该菌株能够主要生产一种具有强效抗结核杆菌活性及抗三阴性乳腺癌活性的天然产物怡莱霉素E，具有广泛的开发应用前景。然而，怡莱霉素E在初始发酵工艺下的得率很低，严重制约怡莱霉素E的系统生物活性研究，成为临床前研究瓶颈。因此，通过基因编辑手段获得怡莱霉素E高产基因工程突变株，开发高产培养基，提高怡莱霉素E滴度，优化规模化发酵工艺和过程参数，实现规模化发酵势在必行。

培养基是微生物生存的物质基础，营养成分合适的培养基对于微生物生长及代谢至关重要。不同微生物的生长及代谢对营养物质的要求均不同，同一微生物在菌体生长和次级代谢产物生产的过程中对营养物质的需求也不同。

发明内容

本发明针对以上瓶颈问题，首先，对发酵生产怡莱霉素E的培养基进行优化研究，以获得高产培养基配方。实验首先对于碳、氮源种类进行优化，后续通过Plaekett-Burman实验设计，筛选出培养基组成中对怡莱霉素E滴度有显著性影响的组分(显著影响因子)，进而通过响应面优化方法对显著影响因子的添加浓度进行优化，最终得到适合怡莱霉素E的高产培养基配方。因此，本发明的第一个目的是提供一种适合深海链霉菌生产怡莱霉素E的高产培养基。

其次，本发明在文献报道的怡莱霉素生物合成途径的基础上，运用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除了怡莱霉素生物合成基因簇中编码细胞色素P450单加氧酶的ilaR后，阻断生物合成途径，提升怡莱霉素E的滴度，获得基因工程菌株深海链霉菌SCSIO ZH16ΔilaR。然后，采用高产培养基进行发酵生产可以显著提升怡莱霉素E滴度，并降低怡莱霉素结构种类，利于后续分离纯化。因此，本发明的第二个目的是提供一株能高效生产怡莱霉素E的基因工程菌株SCSIO ZH16ΔilaR。

再次，本发明通过噬菌体(如ΦC31，ΦBT1和TG1)附着/整合(Att/Int)系统，选用ΦC31位点特异性整合，过表达怡莱霉素生物合成基因簇簇内正调控因子ilaB。成功构建深海链霉菌SCSIO ZH16ΔilaR ilaB::ermE*菌株，采用高产培养基进行发酵，进一步提高怡莱霉素E发酵滴度。因此，本发明的第三个目的是提供一株能高效生产怡莱霉素E的基因工程菌株SCSIO ZH16ΔilaR ilaB::ermE*。