[发明专利]胆固醇和大豆卵磷脂的联合作用在鸡精液冻后中的应用

说明书

本发明提供了一种胆固醇和大豆卵磷脂的联合作用在鸡精液冻后中的应用，0.25wt%胆固醇和0.5wt%大豆卵磷脂提高了鸡精液冻后中的精子活力和精子活率，提高了鸡精液冻后中的精子线粒体活性、质膜完整性和顶体完整性，提高了鸡精液冻后中的抗氧化性能，即提高了超氧化物歧化酶的含量，降低了丙二醛的含量，胆固醇和大豆卵磷脂联合作用时，冷冻稀释液的成分包括：谷氨酸钠、果糖、醋酸钠、柠檬酸钾、氯化镁和二甲基乙酰胺；故在鸡精液冷冻中，Lake’s稀释液中联合添加0.25wt%胆固醇和0.5wt%大豆卵磷脂时，可降低精子氧化损伤，提高精子冻后品质。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种胆固醇和大豆卵磷脂的联合作用在鸡精液冻后中的应用。

背景技术

精液超低温保存是畜禽遗传资源收集和保护中最有价值的技术之一。精液的冷冻保存就是利用干冰、液氮或者其他制冷的设备作为冷源，将精液进行特殊处理之后，保存在极低温度下，抑制精子的代谢活动，使精子处于休眠状态，在合适的温度下复苏精子仍具有受精能力的冷冻保存技术。它被广泛应用于许多哺乳动物的种质资源保护和商业化。在家禽中，虽然精液冷冻用于保护其种质资源，但由于冻后精子存活率低、卵子孵化率低，因此实际应用中技术上还需要进一步优化^[1]。精子冷冻技术一方面可以最大限度地利用遗传优良的雄性，另一方面对保护家禽种质资源具有重要意义。由于家禽精子的特殊结构，对冻融过程的温度变化较为敏感^[2]，还需进一步优化该技术。

胆固醇是构成细胞膜的重要组成成分，占质膜脂类的20％以上。精子在冷冻过程中，由于温度的变化，会使精子内部液体形成冰晶，造成一系列不可逆损伤，这会导致精子的活力、活率下降。精子细胞膜主要是由脂质和蛋白质组成，脂质主要为磷脂和胆固醇。胆固醇作为膜功能的调节剂起着多重作用^[3]，对细胞膜的流动性和渗透压都有着一定的影响。有研究表明，当温度低时，胆固醇可以干扰细胞的有序性，阻止液晶的形成，降低了膜所转换的温度，使膜保持流动的状态，从而减少了精子的低温温度打击^[4]。冷冻过程中精子膜上磷脂和胆固醇的外泄是造成精子冻后活力活率降低、存活时间短的重要原因之一^[5]。据报道，在低温保存期间，50％的猪精液会丢失约为28％的胆固醇。由于膜胆固醇的丢失会使精子失去活力，从而导致精子失活。胆固醇量对维持细胞的完整性和精子获能有很大的关系^[6]，E A M Amorim在公牛精液中添加胆固醇可以有效提高精子细胞冻后存活率^[7]。因此，冷冻前，在基础稀释液中添加少量的胆固醇能够有效地减少精子质膜中的质膜的外泄，提高精子冻后活力活率^[8]。

卵黄是精液冷冻保存过程中最常用的非渗透性冷冻保护剂，能够有效保护精子免受低温打击。但卵黄来源于禽类，可能携带病原微生物，如沙门氏菌、禽流感等，从而影响精子品质。近年来，用于禽流感、疯牛病等大规模畜禽传染病的影响，精液稀释液中的动物源成分也可能造成疫情的传播、交叉感染，甚至可能产生新型疫情^[9]。且卵黄可与精子中的一种蛋白凝固酶发生凝集反应，不利于精子生存^[11]。正由于卵黄等动物源性稀释液诸多的不可控因素，近年来非动物源性冷冻保护剂作为替代剂已成为国内外相关学者研究的热点。大豆卵磷脂是从植物源性大豆中提取的一类基础物质，其核心成分为磷脂酰胆碱。磷脂存在于动植物的细胞中，是构成细胞膜的重要组成部分。大豆卵磷脂能够有效稳定和替代卵黄对精子细胞膜的保护作用，增强精子在冷冻过程中对低温的耐受性^[12]。在羊精液稀释液中的卵黄由大豆卵磷脂取代后，可有效地保护精子免受冷冻打击^[13]。在孙玲伟^[14]的实验中，添加纳米级大豆卵磷脂能有效提高鸡精液冻后的质量。P Gogol等将稀释液中的卵黄替代为大豆卵磷脂在山羊的精液冷冻中也取得了较高的冻后活率P^[15]。但在家禽精液冷冻稀释液中非动物源性冷冻保护剂研究甚少，因此它对家禽精子功能特性的影响尚需要进行进一步探索。