[发明专利]一种促进重组病毒载体向细胞外分泌的方法

说明书

本发明涉及病毒载体制备，提供了一种促进重组病毒载体向细胞外分泌的方法。技术方案如下：在细胞培养或/和病毒接种的过程中，向培养基中加入一种含磺酸基的多糖类化学物质促进病毒载体向细胞外分泌。具体包括如下步骤：(1)细胞复苏；(2)细胞传代；(3)病毒接种及培养；(4)病毒收获。本发明通过在病毒扩增过程中加入一种含磺酸基的多糖类化学物质，促进病毒从胞内向细胞外分泌，从而在病毒收获过程中，无需裂解细胞，直接收获培养上清得到病毒，简化主要位于细胞内的病毒载体的收获工艺。本发明提供的方法工艺简单，不引入去污剂等有害化学物质，无需进行复杂的细胞裂解步骤就可收获病毒，经济环保。

技术领域

本发明涉及病毒载体制备，尤其涉及一种促进病毒载体收获的工艺。

背景技术

基因治疗是指将外源正常基因导入到靶细胞内校正或置换致病基因的一种疗法。通过这种疗法目的基因或与宿主细胞染色体整合或不整合位于染色体外但能在细胞中得到表达起到治疗疾病的目的。虽然病毒或非病毒载体均可以用来作为基因治疗载体，但是病毒载体由于其优异的感染细胞能力和递送基因的能力，是基因治疗的主流。

病毒载体的制备是一项非常复杂的工作，对病毒生产工艺的优化可以提高病毒生产效率。病毒载体的生产包括：细胞培养和扩增、病毒接种、病毒扩增、病毒收获和病毒纯化。病毒扩增后可能分泌至细胞上清，如慢病毒。还有一些病毒，如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘病毒等病毒载体，收获时主要存在于细胞内，因此需要对细胞进行裂解，如去污剂处理、冻融或者超声裂解细胞释放病毒，但是这些裂解细胞的方法有如下缺点，1)增加工艺复杂程度的步骤，需要昂贵的专业设备；2)引入去污剂等有害化学物质；3)细胞裂解后会释放大量宿主DNA和蛋白质等杂质，给病毒纯化带来很大的挑战。对于病毒生产工艺而言，如果这些位于胞内的病毒，在扩增后能主动分泌至细胞上清，将会避免在收获病毒时裂解细胞，极大简化了病毒收获工艺。

发明内容

本发明的目的在于提供一种促进病毒载体分泌至细胞外的方法，从而简化主要位于细胞内的病毒载体的收获工艺。本发明提供的方法工艺简单，不引入去污剂等有害化学物质，无需进行复杂的细胞裂解步骤就可收获病毒，经济环保。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明在细胞培养或/和病毒接种的过程中，向培养基中加入一种含磺酸基的多糖类化学物质，如硫酸葡聚糖及其钠盐、肝素钠等，其特点在于，加入该多糖可以促进病毒载体向细胞外分泌。

本发明公开了一种促进重组病毒载体向细胞外分泌的方法，其特征在于，将培养后的细胞进行病毒接种，在病毒接种过程中，向培养基中加入硫酸葡聚糖。

进一步地，所述病毒接种过程中，向培养基中加入0.01％～1％质量浓度的硫酸葡聚糖。

进一步地，所述硫酸葡聚糖分子量为5kD～500kD。

进一步地，所述病毒接种步骤的病毒加入量＝细胞密度×培养体积×MOI/毒种滴度。

进一步地，所述的病毒为人5型腺病毒或I型单纯疱疹病毒。

进一步地，所述的细胞为HEK293或Vero细胞。

进一步地，所述病毒接种步骤的细胞培养条件为30.0℃～38.0℃，5.0％～8％CO₂。

进一步地，所述病毒接种后还包括病毒收获步骤：病毒接种培养后，收集细胞培养物，离心取上清。

本发明具体包括如下步骤：