[发明专利]一种包含间充质干细胞外泌体的药物组合物在治疗疾病中的应用

说明书

本发明公开了一种包含间充质干细胞外泌体的药物组合物在治疗疾病中的应用，包括以下步骤S1：将人脐带放置于工作台上取出脐带标本置于一次性无菌培养皿中，用组织剪将脐带剪成长约一厘米的小段，将华尔通胶剪至一立方毫米的大小，接种于培养瓶中；S2：当细胞达到70%‑80%融合时，对其进行传代培养，S3：第4代脐带间充质干细胞融合达90%时，用胰蛋白酶进行消化，使用高速离心机对其进行离心处理；S4：此时可将提取到的包含间充质干细胞外泌体应用患者处。本发明所述的一种包含间充质干细胞外泌体的药物组合物在治疗疾病中的应用，此应用不存在未知的潜在杂质污染，并且纯度相对较高，成本也比较低，可以大量地提取，也有利于后续的实验研究。

技术领域

本发明涉及药物组合物领域，特别涉及一种包含间充质干细胞外泌体的药物组合物在治疗疾病中的应用。

背景技术

外泌体是指包含了蛋白质的小膜泡，多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中，所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中，有关他们分泌和摄取及其组成、运载物和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究，外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种包含间充质干细胞外泌体的药物组合物在治疗疾病中的应用，可以有效解决背景技术中的问题。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种包含间充质干细胞外泌体的药物组合物在治疗疾病中的应用，包括以下操作步骤：

S1：准备材料：人脐带、试剂盒、三气培养箱、流式细胞仪、高速离心机、定角转子、透射电子显微镜、凝胶成像仪、可见风光光度计、液体培养基、胎牛血清、青链霉素、牛血清白蛋白、鼠抗人；

S2：将人脐带放置于工作台上取出脐带标本置于一次性无菌培养皿中，使用磷酸盐缓冲液将其充分洗涤，用组织剪将脐带剪成长约一厘米的小段，剔除动静脉血管，将华尔通胶剪至一立方毫米的大小，接种于培养瓶中，加入完全培养基六毫升；

S3：当细胞达到70%-80%融合时，对其进行传代培养，培养至第4代时，对其进行鉴定；

S4：第4代脐带间充质干细胞融合达90%且生长状态良好时，用胰蛋白酶进行消化，待其细胞变圆后加入胎牛血清使其终止消化，反复吹打为单细胞悬液，使用高速离心机对其进行离心处理，弃上清液，加入十毫升的磷酸盐缓冲液将其重悬，于测定管中依次加入20微升抗体荧光染料，同型对照管中加入等量lg荧光染料，于四度的环境下避光进行孵育20分钟；

S5：将生长状态良好的第4代脐带间充质干细胞用胰酶消化，制成单细胞悬液，将其接种于六孔板上，每孔加入二毫升完全培养基进行培养，当细胞长至60%-70%时，吸弃完全培养基，加入二毫升人脐带间质干细胞成骨诱导分化完全培养基，每三天换液1次，诱导二-四周后，吸弃培养基，用磷酸盐缓冲液清洗，细胞经4731.6毫升的多聚甲醛溶液固定三十分钟，使用茜素红染色十分钟，取出显微镜观察胞内的钙结节形成情况；

S6：选择生长状态良好的第4代脐带间充质干细胞6O瓶，用含体积分数为10%的胎牛血清的低糖DMEM培养基培养，待细胞融合至70%-80%时换无血清培养基培养，48-72h后收集条件培养基共600毫升，随后所得上清液经过一次性滤器，收集上清，将条件培养基平均分成3份，每份200毫升，放置备用；

S7：将培养基以300*g离心10分钟去除完整细胞，再经2000*g离心20分钟进一步去除死细胞和杂质，再经10000*g离心30分钟去除细胞碎片，最后以100000*g离心70min，弃上清，将其沉淀用磷酸盐缓冲液重悬后进行保存，保存的温度应为-70度；

S8：此时可将提取到的包含间充质干细胞外泌体应用在血管生产不足的情况下，如急性心肌梗死和缺血。