[发明专利]用于检测肿瘤微小核酸标志物的表面增强拉曼散射检测试剂盒及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种用于非疾病诊断目的的肿瘤微小核酸标志物检测的表面增强拉曼散射检测试剂盒及其制备方法与应用。该试剂盒包括SERS检测芯片，第一、二试剂。SERS检测芯片为表面修饰有发夹型DNA单链H1的银纳米棒阵列基片，第一试剂为发夹型DNA单链H2，第二试剂为SERS探针，在SERS检测芯片上同时加入第一、二试剂后，第二试剂上的探针单链P与H1‑H2双链的粘性末端杂交，将SERS探针捕获至SERS检测芯片上（核酸探针的碱基序列可调），通过测试SERS检测芯片上SERS探针的拉曼信号，实现对于胃癌微小核酸标志物的检测，并且可实现在血清等复杂环境中多种核酸生物标志物的一体化检测，有效提升检测的特异性与准确性。

技术领域

本发明属于功能纳米材料和生物检测领域，具体涉及一种用于肿瘤微小核酸标志物检测的表面增强拉曼散射(SERS)检测试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术

近年来，我国肿瘤的发病率呈逐年上升和年轻化趋势，是仅次于心脑血管疾病的第二段致使疾病。肿瘤通常起病隐匿，早发现、早诊断、早治疗是提高存活率的重要措施。因此，迫切需要在检测技术和方法学上取得突破。以胃癌为例，胃癌是全世界范围内发病率最高的癌症之一，严重威胁着公众的生命健康。据报道，胃癌是全球第四大最常见的癌症，也是全球癌症相关死亡的第三大常见原因。目前，内镜活检仍是胃癌临床诊断的金标准。然而，作为一种侵入性方法，它给患者造成了很大的痛苦，其诊断的准确性依赖于内科医生的技能和经验。肿瘤分子诊断是指以核酸或蛋白为核心的分子生物学诊断技术，是进行肿瘤早期诊断的重要方法。通过检测与肿瘤发生相关的生物大分子，进行肿瘤发生的预测、诊断。肿瘤标志物是指由恶性肿瘤产生或由肿瘤刺激宿主细胞产生，可反映恶性肿瘤的发生、发展及对抗肿瘤治疗反应的物质。其在细胞中表达水平的高低或在体液中含量的变化与肿瘤的发生、发展与转化密切相关。肿瘤标志物是肿瘤分子诊断重要的检测对象之一。MicroRNAs(miRNAs)是由19-25个核苷酸组成的非编码小RNA分子，通过抑制和/或降解mRNA来调控基因表达。研究表明，miRNA表达的失调往往与疾病的发生发展密切相关。此外，越来越多的证据表明miRNA可以作为包括胃癌在内的各种肿瘤类型的生物标志物。

传统的miRNA检测方法包括Northern印迹法、微阵列和实时聚合酶链反应(RT-PCR)，其中以PCR为基础的检测技术是主要的检测方法，然而PCR技术对于引物设计要求高，扩增过程易产生非特异性而导致假阳性结果，检测较为耗时，通常需要2小时以上，操作复杂，需要在专门实验室由专业技术人员完成。这些问题限制了其广泛、便捷应用。表面增强拉曼散射(SERS)因其超灵敏，可实现单个分子水平检测，样品用量少，检测无破坏性，以及可现场即时检测等优点，被认为是一种极具潜力的分子检测技术。针对传统基于PCR的核酸检测技术的不足，需要开发一种用于肿瘤微小核酸(miRNA)标志物检测的表面增强拉曼散射(SERS)检测试剂盒，制备及应用简单，检测无需扩增和专业技术人员操作，检测快速、灵敏度高、特异性好。

发明内容

发明目的：针对当前肿瘤分子检测对于微小核酸标志物快速灵敏测定的重大需求，以及现有以PCR为基础的核酸检测技术在检测特异性、时效性、便携操作性等方面的不足，本发明公开了一种用于非疾病诊断目的的肿瘤微小核酸(miRNA)标志物检测的表面增强拉曼散射(SERS)检测试剂盒及其制备方法与应用。

该SERS检测试剂盒包括SERS检测芯片、第一试剂、第二试剂三部分。其中SERS检测芯片通过在银纳米棒阵列基片表面修饰发夹型DNA单链制备得到，第一试剂为核苷酸序列特殊设计的发夹型DNA单链，第二试剂为SERS探针即修饰有核酸探针链的金纳米球。