[发明专利]一种组织微生物基因组去宿主化提取方法

说明书

本发明涉及一种组织微生物基因组去宿主化提取方法，具体涉及针对人正常胃壁组织、胃癌组织和动脉硬化斑块的微生物基因组去宿主化提取方法。在宏基因组测序中，宿主基因组对微生物基因组存在干扰。通过提高测序样本的微生物基因组丰度，有助于进一步研究组织中微生物与健康的关系。本发明提供了一种新的去除宿主基因组的微生物基因组提取方法，使能对组织中的微生物样品进行宏基因组测序。去除微生物样品中的宿主污染，有助于提高测序基因组质量，满足宏基因组测序要求。

技术领域

本发明涉及一种去除宿主基因组的微生物基因组提取方法，特别涉及在微生物基因组测序样品处理中的应用。

背景技术

肠道微生物对于人体的健康十分重要，已有多项研究均揭示其与疾病的关联。目前发现多种肿瘤和动脉硬化(Atherosclerotic,AS)斑块内部中存在细菌。肿瘤内部微生物已被认为是肿瘤微环境的一部分，斑块菌群也在物理空间上与免疫微环境发挥相互作用。相较于肠道微生物通过代谢产物等间接调控，肿瘤和动脉斑块等实体内部的微生物可能更直接地参加了该疾病的发生和发展。但由于肿瘤组织内细菌含量低，肿瘤微生物组的研究极具有挑战性，目前综合性分析报道较少。其中一个重要原因是缺乏合适的微生物基因组提取方法。

目前常见的DNA提取方法酚-氯仿法在提取微生物基因组中存在宿主DNA污染的问题，已有去宿主微生物基因组提取方法主要针对粪便和液体样品，还没有针对肿瘤和斑块样品中的微生物提取方法。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种新的去除宿主基因组的微生物基因组提取方法，及在微生物基因组测序样品处理中的应用。

本发明采用的技术方案是:

一种组织微生物基因组去宿主化提取方法，包括以下步骤：

1)取组织剪碎置于无酶无菌组织匀浆管中，加入研磨珠和PBS缓冲液。使用Biospec迷你珠磨器最高速度研磨，然后冷却。

2)取一定量步骤1)得到的组织匀浆置于一新的无酶无菌EP管中，加入与组织匀浆等量的宿主DNA去除溶液。

3)室温上下颠倒混匀后，加无菌水，室温30秒，加入NaCl溶液，颠倒混匀后10,000xg离心5min后去上清，保留沉淀。

4)加入微生物裂解缓冲液重悬沉淀，孵育一段时间；

5)将步骤4)得到的溶液加入到无酶无菌组织匀浆管中，加入研磨珠和微生物裂解缓冲液，使用Biospec迷你珠磨器最高速度研磨，然后冷却,重复三至五次。

6)10,000x g离心1min，取上清置于一新的无酶无菌EP管中。

7)向步骤6)的无酶无菌EP管中加入步骤6)中所述上清3倍体积的商品化DNA结合缓冲液，轻柔混匀。

8)将步骤7)得到的的溶液分两次，过商品化DNA纯化柱，10,000x g离心1min。

9)向DNA纯化柱中心加入80％乙醇，10,000x g离心1min，弃离心液。

10)重复步骤9。

11)加入无菌无酶水至纯化柱，室温孵育，离心，收集离心溶液，再次过柱，离心后得到去除宿主基因组的微生物基因组，-80℃保存，以备后续测序。

12)对去除宿主基因组的微生物基因组样本进行宏基因组测序。

步骤1)具体为：取组织30-50mg剪碎置于2mL无酶无菌组织匀浆管中，加入直径2.8mm的研磨珠，250μL 1x PBS缓冲液。使用Biospec迷你珠磨器最高速度研磨1min，冷却5min；研磨、冷却步骤重复三至五次。