[发明专利]功能增强型内皮细胞的驯化方法及驯化得到的细胞制剂

权利要求书

1.功能增强型内皮细胞的诱导驯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、取P2或P3代血管内皮细胞，消化内皮细胞，接种后进行常规维持培养；12～24h后，将维持培养基更换为诱导培养基进行诱导驯化培养；所述的诱导培养基为添加了1～10μMTGF-β抑制剂的高糖、低营养的内皮细胞培养基；高糖是指葡萄糖含量为50～75mM，低营养是指培养基中不含内皮细胞生长添加物；

b、诱导驯化培养至细胞密度达到85％以上时，进行传代，从P2代开始检测细胞表面标记蛋白CD34表达，待CD34表达达到90％以上，结束诱导驯化培养，获得FE-ECs；

c、对步骤b得到的FE-ECs扩大培养，收集扩增的FE-ECs，缓慢加入冻存液，混匀，冻存备用；或将扩增的FE-ECs重悬于生理盐水中，制备成浓度为1×10⁵～1×10⁷个/mL的FE-ECs制剂。

2.根据权利要求1所述的功能增强型内皮细胞的诱导驯化方法，其特征在于：步骤a所述的血管内皮细胞为脐静脉内皮细胞、自体骨髓来源内皮细胞或自体间充质干细胞转分化而来的内皮细胞中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的功能增强型内皮细胞的诱导驯化方法，其特征在于：步骤a所述的维持培养基的组成包括：每500ml基础培养基中添加25ml胎牛血清和5ml内皮细胞生长添加物。

4.根据权利要求1所述的功能增强型内皮细胞的诱导驯化方法，其特征在于：步骤a所述的常规维持培养和驯化培养均是指：在CO₂细胞培养箱中，于37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下进行培养。

5.根据权利要求1所述的功能增强型内皮细胞的诱导驯化方法，其特征在于：步骤c所述的扩大培养采用的培养基组成包括：每500ml基础培养基中添加25ml胎牛血清、50～75mM浓度葡萄糖和1～10μM TGF-β抑制剂。

6.根据权利要求1所述的功能增强型内皮细胞的诱导驯化方法，其特征在于：步骤c所述的冻存保存的冻存液组成包括：按体积百分比计，60％的扩大培养液、30％的胎牛血清、10％的DMSO。

7.权利要求1～6任一项所述的功能增强型内皮细胞的诱导驯化方法制备得到的FE-ECs制剂。

8.权利要求7所述的FE-ECs制剂在制备治疗糖尿病足的药物中的用途。

9.根据权利要求8所述的FE-ECs制剂在制备治疗糖尿病足的药物中的用途，其特征在于：所述的FE-ECs制剂的使用方法为：肌肉内多点注射治疗。