[发明专利]铁-黑色素过氧化物模拟酶在检测总抗氧化能力中的应用

说明书

本发明提供了将铁‑黑色素作为过氧化物模拟酶应用于总抗氧化能力检测中的方法，属于检测分析技术领域。本发明中制备的铁‑黑色素能催化过氧化氢氧化显色底物，加入抗氧化剂后被氧化的显色底物被还原，通过测定还原反应前后的吸光度值，并分析吸光度值与抗氧化剂浓度之间的关系，建立二者的线性方程可以用于检测样品的总抗氧化能力。本发明制备的铁‑黑色素作为过氧化物模拟酶与HRP相比具有更优异的催化性能，还具有优异的稳定性和可重复利用性。按照本发明提供的方法检测总抗氧化能力，最低检测限为12.61μmol/L。

技术领域

本发明属于检测分析技术领域，具体涉及将铁-黑色素作为过氧化物模拟酶应用在总抗氧化能力检测中。

背景技术

辣根过氧化物酶(HRP)与同类过氧化物酶相比具有明显的优势，由于其灵敏度高、分析速度快、背景干扰小，已被广泛应用于生物传感器中用于检测H₂O₂、葡萄糖、乙酰胆碱和抗坏血酸。然而，在检测过程中，暴露的HRP活性中心容易受到温度、pH值、H₂O₂和反应副产物吸附的影响，给检测结果带来很大的不确定性。虽然目前已经开发了许多固定化策略来保护酶的活性和增加其稳定性，但由于固定化过程中酶负荷相对较低，酶的活性损失严重，导致材料的催化效果不足。

受天然酶的启发，人们开发了许多具有类似过氧化物酶催化活性的纳米材料作为模拟酶来构建新型生物传感器。然而，以往基于纳米材料的模拟酶大多存在成本高或制备工艺复杂的问题。例如，中国专利申请CN113617395A中公开了一种用于食品抗氧化活性检测的纳米酶及其制备方法，将六氰基铁酸钾和柠檬酸溶解于水中，然后依次加入四氯金酸钠(III)和硫酸铜，反应得到金掺杂的纳米酶Au@Cu-HCF。该纳米酶既能用于检测氢原子转移类抗氧化物质，又能用于检测单电子转移类抗氧化物质。然而贵金属基纳米酶虽然具有较高的过氧化物酶活性，但其高昂的价格和稀缺性限制了其广泛应用。

因此，模拟酶的安全性和合成方法的简单性还需要进一步提高；迫切需要开发出具有活性高、制备方法简单、成本低和稳定性好的人工过氧化物酶模拟酶，以规避天然酶的缺点。

发明内容

为了解决上述问题，本发明中使用铁-黑色素作为过氧化物模拟酶催化过氧化氢氧化显色底物，并利用抗氧化剂能将氧化后的显色底物还原的作用机理，来实现对总抗氧化能力的快速检测。

为了实现上述目的，本发明中将铁-黑色素作为过氧化物模拟酶用于检测总抗氧化能力的方法包括以下步骤：

S1、向醋酸钠-醋酸缓冲液中加入双氧水、显色底物、铁-黑色素，搅拌均匀得混合液A，所述混合液A中过氧化氢的浓度为1.0mmol/L，显色底物的浓度为1.0mmol/L，0＜铁-黑色素的浓度≤50μg/mL；

S2、取N份所述混合液A，分别加入不同浓度的抗氧化剂水溶液混合均匀，静置孵育，得到N份抗氧化剂浓度各不相同的待测液B；所述待测液B中抗氧化剂的浓度为0～0.3mmol/L，将抗氧化剂浓度为0的所述待测液B作为对照组；

S3、测定步骤S2中N份所述待测液B在350～800nm范围内的紫外-可见吸收光谱，将对照组和其他所述待测液B在652nm处的吸光度值依次记录为Y₀、Y₁、Y₂……Y_N-1；分别计算Y₁、Y₂……Y_N-1与Y₀的差值，对吸光度差值和抗氧化剂浓度进行数据分析，建立抗氧化剂浓度x与吸光度差值Y之间的模型关系，得到检测抗氧化剂的标准曲线为Y＝0.00189x+0.03456；

S4、按照步骤S1和S2中的方法配制抗氧化剂浓度未知的样品溶液，测定所述样品溶液在652nm处的吸光度值，将得到的吸光度值与对照组的吸光度值Y₀的差值代入到步骤S3的标准曲线中，计算出抗氧化剂的浓度。