[发明专利]一种牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体及其制备方法和用途

说明书

本发明公开了一种牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体及其制备方法和用途，涉及基因工程领域，本发明采用RT‑PCR扩增牛源单链抗体编码基因的重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因，利用SOE‑PCR法，将linker与VH基因和VL基因相连构建scFv基因，该scFv按照VL‑Linker‑VH的顺序进行连接，将其克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中构建单链抗体初级文库，辅助噬菌体M13KO7拯救初级文库，用原核表达的Hlb作为包被抗原，经过四轮的富集淘选后，采用phage ELISA方法筛选阳性克隆，获得的单链抗体能够特异性的结合金黄色葡萄球菌Hlb，表现出明显抑制金黄色葡萄球菌Hlb的溶血活性，从而减弱金黄色葡萄球菌对牛乳腺的致病性。

技术领域

本发明涉及抗体药物领域，尤其涉及一种牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体及其制备方法和用途。

背景技术

单链抗体是一种基因工程抗体，通过DNA重组技术将抗体轻链可变区VL和重链可变区VH通过一段连接短肽linker首尾连接而成，是保留完整抗原结合部位的最小功能片段。单链抗体的表达形式主要有融合表达，胞内表达和分泌表达三种形式。和完整抗体相比，单链抗体具有以下优点：1)分子量小，大小仅为完整抗体的六分之一，免疫原性较低；2)组织穿透力强，容易进入实体瘤周围的微循环；3)血液清除快，肾脏蓄积很少；4)无Fc段，非特异结合低；5)易于通过基因工程大量生产；6)易于基因操作，更易构建重组免疫毒素。

奶牛乳腺炎是影响奶牛业发展，给乳品生产造成巨大损失的一种常见多发病。引起奶牛乳腺炎的致病菌很多，其中金黄色葡萄球菌是最重要的致病菌之一，流行率达到了50％，导致严重的经济损失。因为金黄色葡萄球菌具有传染性，且治疗用的抗生素易产生耐药性，所以很难彻底治愈。目前针对金黄色葡萄球菌全菌和多种毒力因子的疫苗也用于奶牛乳腺炎的预防，但是效果均不理想。单链抗体等基因工程抗体，以其独特的抗病毒和抗细菌作用及其能够大规模工程化制备的优势，显示了巨大的研发抗细菌药物的潜力，受到该领域高度重视。

发明内容

本发明的目的是提供一种牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体及其制备方法和用途，该单链抗体能够与金黄色葡萄球菌溶血性毒力因子(Hlb)特异性结合，且具有一定的抑制金黄色葡萄球菌Hlb溶血活性，能够用于金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎的研究。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明首先提供一种牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体，包括轻链可变区VL、重链可变区VH、连接肽Linker，并按照VL-Linker-VH的顺序连接构成牛源单链抗体片段VL-Linker-VH，所述体轻链可变区VL氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述重链可变区VH氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步地，所述牛源单链抗体片段VL-Linker-VH氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明的第二个方面是提供一种抑制奶牛乳腺炎的药物，该药物包括所述牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体。

本发明的第三个方面是提供一种奶牛乳腺炎诊断试剂盒，其特征在于包括所述单链抗体，或者编码所述单链抗体的基因片段以及与之交联的探针。

本发明的第四个方面是提供牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、扩增轻链可变区VL基因和重链可变区VH基因

采用RT-PCR从患奶牛乳腺炎的外周血单个核细胞RNA中扩增出抗体编码基因的轻链可变区VL基因和重链可变区VH基因；

步骤2、合成scFv基因

利用SOE-PCR法将中间连接肽linker、VH基因、VL基因相连，构建牛源性单链抗体基因，即scFv基因；

步骤3、构建重组表达质粒