[发明专利]一种基于Calcein荧光曲线的LAMP检测方法

说明书

本发明公开一种基于Calcein荧光曲线的LAMP检测方法，向包括待测样本的LAMP反应体系中加入Calcein，荧光定量PCR后测定荧光曲线，如果出现V型特征曲线则判定待测样本中具有目标基因，V型特征曲线最低点为峰谷，峰谷出现时间越靠后，待测样本中的目标基因含量越低。本发明的有益效果是：通过Calcein荧光曲线特有的V型结构，能够更为直观的判断扩增结果是阴性还是阳性，检测灵敏，对实验结果的判断更为准确。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，尤其是涉及一种基于Calcein荧光曲线的LAMP检测方法。

背景技术

日本学者Notomi于2000年发明的环介导等温扩增方法（Loop-MediatedIsothermal Amplification，LAMP）可以利用Bst酶和多对引物在60-65℃的恒温条件下实现核酸扩增。从2000年开始，由日本荣研化学研发建立的用于基因诊断的恒温核酸扩增技术。环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）主要是针对靶基因不同的六个区域，设计6条引物（两条外引物、两条内引物和两条环引物），一般在恒温条件40min以内，完成核酸扩增反应，因为其成本低、操作便捷、时间短、灵敏度高等优点，目前已被广泛地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病以及体外诊断中去。本发明针对碳青霉烯酶基因（Klebsiella pneumoniae carbapenemase, KPC）的保守区设计特异的LAMP引物，以便能更敏感特异的检测出相应的基因片段。LAMP结果的读取主要分为浊度检测、琼脂糖凝胶电泳检测和荧光/可视化染料检测等3类方法。但由于浊度检测和电泳检测都依赖于仪器并需要较复杂操作，因而可视化染料检测方法越来越受到专家学者的青睐。该方法只需在LAMP反应开始前于反应体系中加入染料，反应后，阴性反应试剂和阳性反应试剂即会呈现出明显的颜色差异，从而实现反应结果的快速判读。

目前，应用比较广泛的染料由以下两种：1）羟基萘酚蓝（Hydroxynaphthol

Blue，HNB），HNB作为金属离子指示剂，深紫色粉末，易溶于水和乙醇，也可作为LAMP反应可视化指示剂。在LAMP体系中提前加入HNB水溶液，起初镁离子与HNB结合使得反应液为紫色，随着反应的进行，Mg²⁺与析出的P₂O₇^4-反应生成Mg₂P₂O₇沉淀，HNB失去Mg²⁺使得体系颜色变为天蓝色，而未反应的体系则仍保持紫罗兰色；2）钙黄绿素（Calcein），亮黄色粉末，溶于乙醇和碱，微溶于水，荧光指示剂，与Mg²⁺结合而成的复合物可产生强烈荧光，自然光下阴性、阳性结果间存在一定差异，但并不明显。首先在钙黄绿素中加入Mn²⁺，Mn²⁺使钙黄绿素的绿色荧光淬灭。当LAMP扩增反应发生后，产生的副产物焦磷酸离子与Mn²⁺结合并释放钙黄绿素，淬灭状态解除。最终呈现的结果为在365nm蓝光激发下，阳性反应发出强绿色荧光，阴性反应发出较弱绿色荧光。

除了这种可视化指示剂，还可选用一些荧光指示剂，例如SYBR Green i等，其判断方法是观测其荧光曲线形状，看是否出现S型曲线，但是当待测样本中DNA含量较低时，其S型会不太明显，难以判断其检测结果是阳性还是阴性。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种基于Calcein荧光曲线的LAMP检测方法。

本发明采用的技术方案是：一种基于Calcein荧光曲线的LAMP检测方法，向包括待测样本的LAMP反应体系中加入Calcein，荧光定量PCR后测定荧光曲线，如果出现V型特征曲线则判定待测样本中具有目标基因。

优选地，随着时间增加，荧光曲线先降低再升高，形成V型特征曲线。

优选地，V型特征曲线最低点为峰谷，峰谷出现时间越靠后，待测样本中的目标基因含量越低。