[发明专利]一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒，其特征在于：包括用于nfo-RPA酶扩增的引物Mhp-specific-Forward和Mhp-specific-Reverse，与P36基因特异性结合的探针Mhp-specific-Probe，P36阳性质粒，试纸条。

2.根据权利要求1所述的一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒，其特征在于：所述P36阳性质粒序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1或2所述的一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒，其特征在于：所述Mhp-specific-Forward序列为CCCTTGTAATTATATCAACAGGATTAGCAAC；所述Mhp-specific-Reverse序列为[Biotin] TGCCTTTTCCGATTAGTGTCTCCCGTTATG；所述Mhp-specific-Probe序列为[FAM]GGTCTTCCCGCTGTAATTACAATAAAATCAGCAT[THF]CTTTTAGATCTTTATA[SpC]。

4.一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒的制备方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤：

步骤一：猪肺炎支原体的培养；

步骤二：P36阳性质粒的制备：通过生物信息学分析筛选出Mhp的P36基因保守序列，从Mhp基因组中扩增出P36基因并连接到pUC57质粒中构建P36阳性质粒；

步骤三：Mhp nfo-RPA反应体系的建立：以P36保守序列为模板，分别设计P36-Forward和P36-Reverse两条引物从Mhp基因组中扩增出P36基因序列，根据P36基因的序列分别设计用于nfo-RPA酶扩增的引物Mhp-specific-Forward和Mhp-specific-Reverse，以及与P36基因特异性结合的探针Mhp-specific-Probe，将引物、探针、nfo-RPA酶混合建立反应体系，获得Mhp nfo-RPA反应体系。

5.根据权利要求4所述的一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒的制备方法，其特征在于：还包括Mhp nfo-RPA反应体系及条件优化，其包括如下步骤：

选取稀释浓度为2×10⁸ copies/μL的P36质粒模板，分别设置多个时间梯度进行nfo-RPA扩增反应，待反应结束后，取出反应管置于冰上结束反应，并在胶体金试纸条中观察结果，验筛可见清晰的扩增条带对应的最佳反应时间；

在上述筛选出最佳反应时间的基础上，进一步设置多个温度梯度进行nfo-RPA扩增反应，并在胶体金试纸条中观察结果，确定最佳反应温度。

6.根据权利要求5所述的一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒的制备方法，其特征在于：还包括Mhp nfo-RPA反应体系灵敏度验证，其包括如下步骤：

以P36阳性质粒标准品2×10⁹ copies/μL为初始浓度，按10倍梯度稀释，在最佳反应时间和最佳反应温度条件下分别以稀释浓度为2×10⁹ copies/μL、2×10⁸ copies/μL、2×10⁷ copies/μL、2×10⁶ copies/μL、2×10⁵copies/μL、2×10⁴ copies/μL、2×10³ copies/μL、2×10² copies/μL、2×10¹ copies/μL、2×10⁰ copies/μL的P36阳性质粒为模板，ddH₂O为阴性对照进行nfo-RPA扩增反应，并在胶体金试纸条中观察结果。