[发明专利]飞秒激光加工细胞的多尺度连续观测反馈方法及装置

权利要求书

1.一种飞秒激光加工细胞的多尺度连续观测反馈方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、由超短脉冲激光器产生的超快激光经过多频脉冲序列产生器后变为具有飞秒量级时间延时的脉冲序列，所述脉冲序列通过分束的方法被分成两束，其中一束脉冲序列通过物镜进行聚焦，作用在微流控器件所控制细胞流速的细胞上，进行细胞的多频脉冲飞秒激光无损或微创调控加工；另一束激光脉冲序列通过细胞后，携带有超快信息，由CCD相机接收，生成超快连续图像并储存于电脑中；

步骤二、提取步骤一中CCD相机拍摄到的约束于微流器件中的细胞图像，每张所述细胞图像中包含一个或多个细胞，经过细胞图像处理方法计算出细胞等效直径数值d，输出至协同控制器中；计算出时域展宽探测图像的时间分辨率t，t为时域展宽脉冲产生器的激光脉冲重复频率f的倒数，求出激光脉冲重复频率；根据所需探测图像的时间跨度T以及细胞等效直径d与细胞流速v的匹配关系式：，计算出细胞流速v，设置微流控器件的参数，实现对探测过程的反馈调节；

步骤三、协同控制器触发时域展宽脉冲发生器，产生步骤二计算所得的所述重复频率为f的脉冲激光，经过时域展宽脉冲发生器产生具有纳秒至毫秒量级范围内任意时间延时的激光脉冲，作用于细胞后由图像探测器收集到细胞在该时间分辨率下的时域展宽探测图像，存储于电脑中，结合CCD相机接收到的超快连续图像，得到多尺度细胞连续观测信息，观测细胞生物反应过程，指导飞秒激光细胞加工的优化；所述细胞生物反应过程包括细胞形态、细胞流动、细胞膜穿孔、细胞愈合。

2.如权利要求1所述的飞秒激光加工细胞的多尺度连续观测反馈方法，其特征在于，所述步骤二中细胞图像处理方法实现方法为，

（1）将步骤一中的包含细胞形貌的超快连续图像转换成灰度图片，绘制出所述超快连续图像的灰度直方图；

（2）从灰度直方图的波谷选择一个阈值做二值切分，将图片处理成二值化图像；

（3）将二值化图像中的孔洞填充，将细胞之间的连接线删除，实现分割细胞粘连目的；

（4）进行形态学开运算，提高图像视觉圆滑效果；

（5）计算出每个细胞覆盖面积的大小，排除面积太小或太大的块轮廓；

（6）然后求连通域重心以及在重心坐标点描绘数字，最终生成细胞计数标记图像；

（7）输出细胞等效直径d。

3.一种飞秒激光加工细胞的多尺度连续观测反馈装置，用于实现如权利要求1或2所述的飞秒激光加工细胞的多尺度连续观测反馈方法，其特征在于：包括超短脉冲激光器、多频脉冲序列产生器、加工物镜、用于控制细胞流动速度的微流控器件、协同控制器、时域展宽脉冲产生器、空间分光器、空间光合束器、图像探测器、若干分束镜、CCD相机和计算机；由超短脉冲激光器产生的超快脉冲激光经过多频脉冲序列产生器转化为由具有时间延时的若干多频脉冲激光组成的脉冲序列，经过分束镜被分成两束，其中一束通过加工物镜用于对细胞进行激光加工，另一束经过细胞后，采集细胞加工过程的飞秒时间尺度内的细胞信号，携带有成像信息的所述多频脉冲激光通过若干分束镜分离，进入CCD相机采集信号，生成超快连续图像存储于计算机中；所述超快连续图像经过细胞图像处理方法识别出细胞等效直径d至协同控制器中，随后，根据步骤二中的所述激光脉冲重复频率f与所述细胞流速v，调节微流控器件的参数以调节细胞流速，利用协同控制器触发时域展宽脉冲产生器后使其产生具有纳秒至毫秒量级时间延时的不同频率的脉冲激光，利用空间分光器将不同频率的所述脉冲激光分离并作用在细胞上，收集到细胞加工过程的纳秒至毫秒内任一时间尺度的信号，利用空间光合束器汇聚不同时刻所述脉冲激光携带的成像信息于相同空间位置，依次通过图像探测器接收信号，形成时域展宽探测图像并存储于计算机中；经计算机处理后，得到多尺度细胞加工成像信息，观测到细胞加工过程中的光刺激、烧蚀过程，反馈细胞加工过程及结果；所述多尺度包括飞秒、纳秒、微秒或毫秒。

4.如权利要求3所述的飞秒激光加工细胞的多尺度连续观测反馈装置，其特征在于：所述超短脉冲激光器为能够产生单一波长且脉冲宽度为飞秒量级激光的超快激光器。