[发明专利]绿色荧光蛋白鲨源纳米抗体、制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种绿色荧光蛋白鲨源纳米抗体、制备方法及其应用。纳米抗体核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑6，氨基酸序列如SEQ ID NO：7‑12；制备是将绿色荧光蛋白免疫条纹斑竹鲨，提取外周血淋巴细胞总RNA并反转录为cDNA；扩增VNAR片段，并与噬菌粒连接，构建噬菌体抗体文库；从文库中筛选绿色荧光蛋白特异性的纳米抗体序列并重组表达，获得靶向绿色荧光蛋白的鲨源纳米抗体。本发明的纳米抗体来源于条纹斑竹鲨，其分子量小、稳定性强、组织穿透能力强以及可识别隐藏抗原表位，可用于绿色荧光蛋白的亲和纯化、免疫学检测、分子成像、免疫传感探针等领域。

技术领域

本发明属于生物技术领域的一种绿色荧光蛋白抗体及其制备方法，具体涉及一种绿色荧光蛋白鲨源纳米抗体及其制备方法。

背景技术

1993年天然轻链缺失的仅含重链的抗体(HcAbs)首先在骆驼科动物中被发现。1995年，在护士鲨(Ginglymostoma cirratum)体内发现了具有类似重链抗体结构的免疫球蛋白，被称为免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)。与传统免疫球蛋白支架的可变区相似，鲨鱼新型抗原受体可变区(VNAR)被确定具有4个高度保守的骨架区域(FR)和3个高度可变的互补决定区域(CDRs)，该区域被称为单域抗体(sdAb)。由于FR2-CDR2的大量缺失使VNAR成为已发现的具有结合功能的最小抗体片段，分子量约为12kDa。单域抗体蛋白直径小于10纳米，因此又被称为纳米抗体。与传统的单克隆抗体相比，纳米抗体很容易被生产和改造，在一定程度上增加了其实际应用性，而纳米抗体被广泛的应用离不开其特有的优势。VNAR所具有的分子量小、稳定性强、亲和力和特异性高、溶解度好、组织穿透能力强以及可识别隐藏抗原表位等特点，使其在应用时具有生产成本低、质量稳定等优点。在分子成像、疾病诊断、免疫检测、环境监测等领域具有潜在的应用前景。

1962年由下村修等人在维多利亚多管发光水母中发现绿色荧光蛋白(Greenfluorescent protein,GFP)。GFP是一类存在于海洋腔肠动物体内的生物发光蛋白，由238个氨基酸组成，在蓝光照射下发出绿色荧光。绿色荧光蛋白对生物体细胞和组织基本无毒无害，且其荧光信号稳定、易于检测，因此被广泛应用于免疫学检测、细胞成像、亲和纯化及蛋白质工程等领域。

抗GFP纳米抗体可以在体内和体外与GFP结合，从而在亚细胞定位、蛋白质活性、蛋白质相互作用等方面广泛应用。GFP纳米抗体可作纯化的亲和配基，用于纯化GFP标签蛋白。高亲和力的抗GFP纳米抗体可与辣根过氧化物酶进行偶联用作检测二抗，相比于市场上现有的检测二抗，其灵敏度更高。纳米抗体还可以作为新型免疫传感探针，通过综合运用免疫分析和荧光共振能量转移原理，开发一种基于荧光纳米抗体的荧光共振能量转移纳米传感器。目前尚无抗绿色荧光蛋白的鲨源纳米抗体序列专利。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，本发明提供了能以高亲和力结合绿色荧光蛋白的鲨源重链抗体可变区序列(VNAR)，该可变区序列又称为纳米抗体，其能够用于绿色荧光蛋白的亲和纯化、免疫学检测、细胞成像、免疫传感探针等领域。

本发明所采用的技术方案是：

一、一种绿色荧光蛋白鲨源纳米抗体：

所述鲨源纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示；所述鲨源纳米抗体的氨基酸序列如SEQID NO.7或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示。

所述鲨源纳米抗体在绿色荧光蛋白的亲和纯化、免疫学检测、细胞成像等领域的应用。

二、一种绿色荧光蛋白鲨源纳米抗体的制备方法，所述鲨源纳米抗体的制备方法按照以下步骤进行：

1)制备绿色荧光蛋白；

2)免疫条纹斑竹鲨；