[发明专利]靶向SARS-CoV-2RBD蛋白的鲨源纳米抗体、制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种靶向SARS‑CoV‑2 RBD蛋白的鲨源纳米抗体、制备方法和应用。纳米抗体核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑4，氨基酸序列如SEQ ID NO：5‑8；制备是将RBD蛋白免疫条纹斑竹鲨，提取外周血淋巴细胞总RNA并反转录为cDNA；再将扩增得到的VNAR片段与扩增的pR2噬菌粒通过无缝克隆连接，转化TG1感受态细胞，构建噬菌体抗体文库；从文库中筛选SARS‑CoV‑2 RBD蛋白特异性的纳米抗体序列并重组表达，获得靶向的鲨源纳米抗体。本发明的纳米抗体分子量小，可利用配对的纳米抗体检测SARS‑CoV‑2 RBD抗原，可应用于SARS‑CoV‑2 RBD蛋白的免疫印迹、酶联免疫吸附实验以及COVID‑19制药应用。

技术领域

本发明属于生物技术领域的一种SARS-CoV-2抗体及其制备方法，具体涉及一种靶向SARS-CoV-2 RBD的鲨源纳米抗体及其制备方法。

背景技术

SARS-CoV-2属于冠状病毒，其通过表面突刺蛋白(spike)的受体结合区域(RBD)与上皮细胞表面的血管紧张素转换酶2(ACE2)结合后进入细胞，完成侵染。

从康复患者体内分离的全人源抗体被证实具有很好的抗病毒作用，这些传统的单克隆抗体由2条重链和2条轻链组成，具有分子量大，生产工艺复杂，不易加工改造等局限性。相对于传统的抗体，驼类或软骨鱼类(如鲨鱼)体内存在一种仅由2条重链组成的抗体，命名为重链抗体，其抗体可变区仅由2个相同的重链可变区组成，该区域被称为单域抗体(sdAb)。单域抗体蛋白直径小于10纳米，因此又被称为纳米抗体。羊驼和鲨鱼的单域抗体分别称为VHH和VNAR。单域抗体比传统的scFv或Fab具有居多优势，其分子量小、穿透性强、稳定性及可溶性更高，其发挥功能不依赖糖基化修饰等。与传统抗体相比，单域抗体通常具有一个扩展的CDR3，可以形成一个凸出的表面结构来识别抗原表位，因此可以利用其帮助识别传统抗体难以识别的隐藏抗原表位。目前在单域抗体方面研究开发最好的是羊驼单域抗体，其在探索抗原受体起源，研发疫苗、治疗药物、诊断试剂和生物技术研究工具等方面已取得较好进展。同理，可将鲨源单域抗体开发成诊断试剂、治疗性抗体药物等。目前尚无抗SARS-CoV-2 RBD的鲨源纳米抗体序列专利。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，本发明提供了能以高亲和力结合新冠病毒(SARS-CoV-2)受体结合区域(RBD)的鲨源重链抗体可变区序列(VNAR)，该可变区序列又称为纳米抗体，其能够用于预防、治疗和/或诊断SARS-CoV-2感染，能够用于相关制药应用。

本发明的技术方案如下：

一、一种靶向SARS-CoV-2 RBD的鲨源纳米抗体：

所述鲨源纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

所述鲨源纳米抗体氨基酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示，将抗体分别命名为sh-aRBD-2、sh-aRBD-5、sh-aRBD-17、sh-aRBD-18。

二、一种靶向SARS-CoV-2 RBD的鲨源纳米抗体的制备方法：

所述鲨源纳米抗体的制备方法按照以下步骤进行：

采用体外重组表达的SARS-CoV-2 RBD蛋白作为抗原对鲨鱼进行免疫，免疫后抽取外周血，对于外周血利用质量分数为30％的蔗糖溶液采用密度梯度离心法分离获得淋巴细胞，抽提淋巴细胞溶液的总RNA，随后反转录为cDNA；

再以cDNA为模板，用特异性引物扩增出VNAR基因序列，将VNAR基因序列插入pR2噬菌粒扩增产物中，然后电转化到TG1感受态细菌中，在涂布平板上培养，刮取平板上的菌落得到噬菌体展示抗体文库，再经过多重筛选、重组表达和纯化得到SARS-CoV-2 RBD鲨源纳米抗体。