[发明专利]一种糖醛酸脱氢酶突变体及其在制备糖二酸中的应用

权利要求书

1.一种糖醛酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体包括A97Y、A97H、L104F、A110V、T170V、E231K、E242C、E242N、A97H/L104F、A97H/E231K、L104F/E231K、A110V/T170V、A97H/L104F/E231K、A110V/T170V/E242N、A97H/E231K/E242N中的任意一种或者多种，所述突变体对应的野生型氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种糖醛酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体对应的野生型的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述突变体A97Y，即第97位丙氨酸密码子GCG突变为了酪氨酸密码子TAT；所述突变体A97H，即第97位丙氨酸密码子GCG突变为了组氨酸密码子CAT；所述突变体L104F，即第104位亮氨酸密码子CTG突变为了苯丙氨酸密码子TTT；所述突变体A110V，即第110位丙氨酸密码子GCG突变为了缬氨酸密码子GTT；所述突变体T170V，即第170位苏氨酸密码子ACC突变为了缬氨酸密码子GTT；所述突变体E231K，即第231位谷氨酸密码子GAA突变为了赖氨酸密码子AAA；所述突变体E242C，即第242位谷氨酸密码子GAA突变为了半胱氨酸密码子TGT；所述突变体E242N，即第242位谷氨酸密码子GAA突变为了天冬酰胺密码子AAT；所述突变体A97H/L104F，即第97位丙氨酸密码子GCG突变为了组氨酸密码子CAT，同时第104位亮氨酸密码子CTG突变为了苯丙氨酸密码子TTT；所述突变体A97H/E231K，即第97位丙氨酸密码子GCG突变为了组氨酸密码子CAT，同时第231位谷氨酸密码子GAA突变为了赖氨酸密码子AAA；所述突变体L104F/E231K，即第104位亮氨酸密码子CTG突变为了苯丙氨酸密码子TTT，同时第231位谷氨酸密码子GAA突变为了赖氨酸密码子AAA；所述突变体A110V/T170V，即第110位丙氨酸密码子GCG突变为了缬氨酸密码子GTT，同时第170位苏氨酸密码子ACC突变为了缬氨酸密码子GTT；所述突变体A97H/L104F/E231K，即第97位丙氨酸密码子GCG突变为了组氨酸密码子CAT、第104位亮氨酸密码子CTG突变为了苯丙氨酸密码子TTT且第231位谷氨酸密码子GAA突变为了赖氨酸密码子AAA；所述突变体A110V/T170V/E242N，即第110位丙氨酸密码子GCG突变为了缬氨酸密码子GTT、第170位苏氨酸密码子ACC突变为了缬氨酸密码子GTT且第242位谷氨酸密码子GAA突变为了天冬酰胺密码子AAT；所述突变体A97H/E231K/E242N，即第97位丙氨酸密码子GCG突变为了组氨酸密码子CAT、第231位谷氨酸密码子GAA突变为了赖氨酸密码子AAA且第242位谷氨酸密码子GAA突变为了天冬酰胺密码子AAT。

3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒优选携带权利要求2任意所述的突变体的基因。

4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的表达载体为pET-20b(+)质粒。

5.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌携带权利要求2任一所述的突变体基因或权利要求3的所述重组质粒。

6.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌宿主为E.coli BL21(DE3)。

7.一种权利要求1或者2所述的糖醛酸脱氢酶突变体或者权利要求3所述的重组质粒或者权利要求5所述的重组菌在生产糖二酸中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的应用包括如下步骤：构建反应体系，底物为糖醛酸，加入糖醛酸脱氢酶突变体，在缓冲液下反应得到转化液，其中含有糖二酸。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，在缓冲液下反应得到转化液其转化温度为45～55℃，pH为7.0～7.5，转化时间为1～6h，底物糖醛酸浓度为0.2～100mg/mL，酶添加量为0.1～50U/mL。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，重组菌在生产糖二酸过程为：将大肠杆菌工程菌发酵培养，获得种子液；将种子液接种至发酵培养基内进行高密度培养，然后向其中加入诱导剂，继续培养，获得发酵液；将发酵液离心收集菌体，洗涤，离心后再用洗涤液重悬细胞；将透性化试剂加入细胞悬液处理后离心收集细胞，洗涤重悬后，再次离心；将细胞加入反应液进行全细胞转化，获得糖二酸。