[发明专利]一种评估肝脏衰老的方法

权利要求书

1.一种评估肝脏衰老的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、取外周血，采用溴甲酚绿比色法测定血清白蛋白含量；

S2、另取外周血，加入高氯酸充分混匀裂解至其由红色变为棕色，随后离心10min，取上清，加入NAD+提取液，充分混匀，静置等待分层，取最上层液体作为样品；

S3、取样品稀释液加入到样品中进行稀释，向96孔板中加入样品，分别向每个孔中加入反应液，避光孵育40min；

S4、加入硫酸终止反应，上酶标仪，根据标准品获得的方程对样品进行计算，得出样品的NAD+浓度；

S5、使用Magen试剂盒提取外周血中的基因组DNA，取基因组DNA，加入Hinf I、Rsa I、RNase A酶切，过夜，加入DNA loading buffer；用琼脂糖胶，TAE缓冲液，电泳12-16h，溴酚蓝距胶孔15cm时停止电泳；

S6、将步骤S4所得琼脂糖胶放置于干胶仪上，抽真空干胶1h，往干好的琼脂糖胶加入变性液反应，随后加入中和液反应，接着加入预杂交液反应，杂交过夜；

S7、将步骤S5所得加入洗液Ⅰ，清洗15min，重复3次，随后加入洗液Ⅱ，清洗15min，重复2次，用保鲜膜包好，磷屏曝光3h，扫屏，处理数据，计算平均端粒长度;

S8、采用统计软件作图，基于普通人群的端粒长度（T）、NAD+浓度（N）和血清白蛋白（A）三个指标的大数据统计进行比较，依据检测数值在统计图中的分布位置进行评分，分值范围0-100分，将分值代入计算公式，以评估肝脏衰老指数（La），评估肝脏衰老指数计算公式为：La=0.15*T+0.1*N+0.75*A。

2.如权利要求1所述的一种评估肝脏衰老的方法，其特征在于，步骤S2所述的NAD+提取液是由3体积1,1,2-三氯三氟乙烷与1体积三辛胺充分混匀而得。

3.如权利要求1所述的一种评估肝脏衰老的方法，其特征在于，步骤S3所述的样品稀释液是用800体积的水加入3体积的1M，pH=8.0的Tris缓冲液所得，所述反应液由以下组分组成：61mmol/L、PH为7.4的双苷肽，CCK-8，2.6千单位/mL的乙醇脱氢酶，3.5mol/L的烟酰胺，无水乙醇；上述组分的体积比为820:100:5:28.5:57。

4.如权利要求1所述的一种评估肝脏衰老的方法，其特征在于，步骤S6所述的变性液由1.5M氯化钠和0.5M氢氧化钠组成，所述中和液由1.5M 氯化钠和0.5M PH为8.0的Tris-HCl组成，所述预杂交液由10X Denhardt's溶液、5X SSC缓冲液、0.5% SDS组成。

5.如权利要求1所述的一种评估肝脏衰老的方法，其特征在于，步骤S7所述的洗液I为2X SSC缓冲液，含0.5%SDS，所述洗液II为2X SSC缓冲液，含0.1%SDS。

6.如权利要求1所述的一种评估肝脏衰老的方法，其特征在于，所述步骤S2离心时，其环境温度为4℃。

7.如权利要求1所述的一种评估肝脏衰老的方法，其特征在于，所述步骤S6中，变性液反应时间为30min，中和液反应时间为30min，预杂交液反应时间为1h。