[发明专利]一种可调节的先导编辑器及其应用

权利要求书

1.一种基因先导编辑系统，包含载体，所述载体含有编码sgRNA的基因、编码分离的先导RNA的基因以及编码融合蛋白的基因，其特征在于，所述分离的先导RNA包含逆转录模板RTT、主要结合位点PBS、RNA茎环结构。

2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述融合蛋白为RNA结合蛋白RBP、Cas9切口酶或其变体、逆转录酶的融合蛋白；或，所述融合蛋白包括：包含RNA结合蛋白RBP与第一诱导结合分子的第一融合蛋白，以及包含Cas9切口酶或其变体、逆转录酶、第二诱导结合分子的第二融合蛋白片段。

3.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述RNA茎环结构选自以下至少一项：

1)序列分别如SEQ ID NO.1～5所示的MS2、PP7、ComBS、Csy4BS、boxB；

2)在1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的RNA序列；

3)与1)或2)的RNA序列具有85％以上的同一性的RNA序列。

4.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，选自以下至少一项：

1)所述RNA茎环结构连接于所述主要结合位点PBS的3’端，和/或逆转录模板RTT的5’端；

2)所述分离的先导RNA从5’端至3’端依次为逆转录模板RTT、主要结合位点PBS和RNA茎环结构；

3)所述分离的先导RNA从5’端至3’端依次为RNA茎环结构、逆转录模板RTT、主要结合位点PBS；

4)所述分离的先导RNA为线性或环形；

5)所述RBP为特异性结合RNA茎环结构的蛋白；所述RBP为一个或多个；

6)所述载体为一个或多个；

7)所述编码sgRNA的基因、编码分离的先导RNA的基因以及编码融合蛋白的基因为一个或多个；

8)所述编码sgRNA的基因、编码分离的先导RNA的基因以及编码融合蛋白的基因位于同一载体或不同载体上；

9)所述第一诱导结合分子、第二诱导结合分子为适于通过诱导分子进行结合的分子；

10)所述第一诱导结合分子位于RBP的N端或C端；

11)所述第二融合蛋白片段由N端至C端依次包括第二诱导结合分子、Cas9或其变体、逆转录酶；或，所述第二融合蛋白片段由N端至C端依次包括Cas9或其变体、逆转录酶、第二诱导结合分子。

5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，选自以下任一项：

1)所述RBP选自tdMCP、tdPCP、COM、Csy4H29A、N22p中的任一种；

2)所述Cas9切口酶为H840A；

3)所述逆转录酶为MMLV；

3)所述第一诱导分子、第二诱导分子分别独立地选自两对蛋白FKBP和FRB或者ABI和PYL1中的一种；

4)所述系统还含有筛选标记蛋白。

6.一种分离的先导RNA，其特征在于，所述分离的先导为权利要求1～5任一项所述的系统中所述的分离的先导RNA。

7.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含RNA结合蛋白RBP与第一诱导结合分子，或者，所述融合蛋白包含Cas9切口酶或其变体、逆转录酶和第二诱导结合分子。

8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，选自以下至少任一项：

1)所述第一诱导结合分子、第二诱导结合分子为适于通过诱导分子进行结合的分子；

2)所述第一诱导分子、第二诱导分子分别独立地选自两对蛋白FKBP和FRB或者ABI和PYL1中的一対；

3)所述Cas9切口酶为H840A；

4)所述逆转录酶为MMLV。

9.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求6所述的分离的先导RNA和/或权利要求7或8所述的融合蛋白。

10.一种构建体，所述构建体含有如权利要求9所述的核酸。